[發明專利]微生物酶法生產磷酸肌酸的方法

無效

• 申請號: 201210301825.8
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102808006A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 高智慧;任麗梅;劉磊;姚瑞娟;余瓊林;王文芳;劉陽
• 申請（專利權）人: 天津啟仁醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于生物技術生產磷酸肌酸的技術領域，涉及通過微生物酶法轉化肌酸和三磷酸腺苷生產磷酸肌酸的方法。

背景技術

磷酸肌酸（Creatine?phosphate，CP或Phosphocreatine，PCr或PC）也稱肌酸磷酸，是肌酸的重要衍生物，于1927年于哺乳動物肌肉中分離得到。在高能量轉換的細胞內，磷酸肌酸至少有以下兩種作用：一是作為細胞內的能量載體，二是作為一種能量緩沖劑。磷酸肌酸作為人體內的一種高能儲存物質，已被廣泛用于各類心臟病的防治藥物，也可作為營養品直接服用，同時作為生化制劑已被廣泛用于臨床診斷中。

目前磷酸肌酸的制備方法主要有：

（1）經典法是以肌酸為起始原料，在NaOH溶液中滴加三氯氧磷進行縮合反應，經鋇或鈣鹽交換純化得到磷酸肌酸二鈉鹽。這種方法引入的可溶性鋇鹽具有強烈的毒性，因此對于需要生產供注射用藥的磷酸肌酸二鈉鹽，該工藝可能存在一定的風險。

（2）有機合成法是通過制備磷酸肌酐中間體，重結晶純化，然后加氫脫芐基，獲得肌酐磷酸鈉，進一步在氫氧化鈉水溶液中加熱開環得磷酸肌酸二鈉鹽。這種方法步驟多、成本高，同時引入氫氣，操作上具有一定的危險性。

（3）生物轉化法是以微生物細胞或從生物體中提取的酶作為生物催化劑，利用酶的專一性制備磷酸肌酸，具有反應條件溫和、反應速度快和專一性強等優點。已有報道的中國專利CN02129203.5采用從兔肌肉中提取的肌酸激酶，以磷酸和肌酸為原料，生物酶催化合成磷酸肌酸二鈉鹽。但由于他采用的肌酸激酶酶活力較低，且受來源限制，不能規模制備，因此不具有產業化價值。

肌酸激酶（EC2.7.3.2），通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、TP再生有直接關系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應，反應式如圖1所示。

不過，傳統的酶法采用的肌酸激酶一般提取自動物肌肉，這種采用動物肌肉細胞漿制備的粗酶體系作為酶源，勢必引入較多的雜蛋白到反應體系中，將給轉化后的分離提取工藝帶來困難；也有發明采用3-磷酸甘油酸作為起始底物，采用包括肌酸激酶在內的復合酶系，但由于參與反應的酶較多，各種酶所要求的最適條件不同，因此不能保證同時滿足所有酶的最適條件，最終是影響磷酸肌酸的產率。

發明內容

本發明的目的就是解決現有磷酸肌酸制備技術中存在的上述問題，提供一種成本低、產率高、環保無污染的微生物酶法生產磷酸肌酸的綠色轉化方法。

本發明提供的微生物酶法生產磷酸肌酸的方法包括：以表達肌酸激酶的基因工程重組菌的發酵菌體細胞或裂解液為酶源，以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在室溫至45℃下，pH9至11，經酶法轉化反應0.5至5h，生產磷酸肌酸。其中，酶促反應液中，底物肌酸的加入量為5至15g/L，三磷酸腺苷的加入量為2.5至10g/L，酶源的添加量為300至900U/L，輔助因子無水硫酸鎂的加入量為32.5至95mmol/L。

底物肌酸的用量優選為10g/L，三磷酸腺苷的用量優選為7.5g/L，酶源的添加量優選為450U/L，無水硫酸鎂的添加量優選為65mmol/L，優選轉化溫度為37℃，優選轉化pH9，優選轉化時間3h。

所述的表達肌酸激酶的基因工程重組菌為大腸桿菌BL21(DE3)-pET21a(+)-CPK，表達載體為pET21a(+)-CPK重組表達載體，重組菌體細胞中表達有高活性的肌酸激酶。

所述的表達L-精氨酸酶的基因工程重組菌的宿主菌為大腸桿菌BL21，表達載體為pET21a(+)-CPK重組表達載體。

本發明自行構建了高效表達肌酸激酶的大腸桿菌基因工程菌株BL21(DE3)-pET21a(+)-CPK，即從小鼠肌肉中提取總RNA，構建含有小鼠肌酸激酶基因的大腸桿菌基因工程菌，該菌體細胞的肌酸激酶酶活力可達30U/g。收集菌體，進行超聲波破碎獲得肌酸激酶的粗酶液，酶活約為6U/mL。

在本發明實施例中，采用高效液相色譜法來測定磷酸肌酸的含量，具體方法如下：高效液相色譜采用C18柱（150×4.6mm）對磷酸肌酸的含量進行測定，該液相條件為：以乙腈-磷酸鹽（5:95）為流動相，其中磷酸鹽配方為0.2%磷酸二氫鉀和0.08%四丁基硫酸氫銨；進樣量10μL；總流速為1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫為25℃。

本發明的優點和有益效果：