[發(fā)明專利]小鼠抗人β-Tubulin單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210300702.2
• 申請日: 2012-08-22
• 公開（公告）號: CN102776154A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張林剛;郗日沫;尹芝南
• 申請（專利權(quán)）人: 天津三箭生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C12N15/13;C07K16/18;C12R1/91
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及以原核表達(dá)的β-Tubulin蛋白免疫小鼠獲得的分泌β-Tubulin單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3G7，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Tubulin即微管蛋白，是細(xì)胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種微管蛋白，其中α微管蛋白(α-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種微管蛋白。β-Tubulin是由455個氨基酸組成，分子量為55kDa。α-Tubulin和β-Tubulin這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu),能夠緊密地結(jié)合成二聚體,作為微管組裝的亞基。

微管壁由13個原纖維排列組成，微管可裝配成單管，二聯(lián)管（纖毛和鞭毛中），三聯(lián)管（中心粒和基體中）。細(xì)胞內(nèi)微管以胞質(zhì)微管和紡錘體微管兩種形式存在，主要參與細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞器的定位、胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸及真核細(xì)胞的有絲分裂過程。細(xì)胞進(jìn)入分裂期，其胞質(zhì)微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。在分裂后期，紡錘體微管牽引著姐妹染色單體從赤道面移向紡錘體的兩極。在有絲分裂結(jié)束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質(zhì)微管。因此，這種微管蛋白／微管之間的動態(tài)循環(huán)(聚合和解聚)，為細(xì)胞正常有絲分裂所必需。若破壞此循環(huán)將致使進(jìn)入有絲分裂期的細(xì)胞停止分裂，進(jìn)而延長細(xì)胞周期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞具有快速增殖能力，若抑制其紡錘體的形成，必將導(dǎo)致有絲分裂過程的阻斷，使得腫瘤細(xì)胞生長停滯于G2／M期。β-微管蛋白可專一性地與某些抗有絲分裂藥物，如秋水仙堿(colchicine)、長春花堿和鬼臼素等相結(jié)合。一旦與藥物相結(jié)合后就阻止其他蛋白單體的繼續(xù)添加而抑制微管的聚合，同時還通過誘導(dǎo)微管的解聚抑制紡錘體的形成，使細(xì)胞的有絲分裂停止于M期，從而阻止細(xì)胞分裂繁殖；紫杉醇類等藥物在β-微管蛋白上的結(jié)合腔靠近異二聚體和原絲間的重要作用區(qū)域，因而在藥物與微管蛋白結(jié)合的同時也加強(qiáng)了異二聚體和原絲間的結(jié)合，結(jié)果促進(jìn)了微管蛋白的聚合又能穩(wěn)定已形成的微管(抗低溫及抗Ca²⁺的解聚)，使細(xì)胞分裂停止于G2／M期。

與正常細(xì)胞相比較，腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)更加敏感，作用于微管的抗癌藥物更容易殺死腫瘤細(xì)胞，與其他類型藥物相比具有更好的療效。另外，β-微管蛋白表達(dá)異常與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，大量的研究表明，α、β-微管蛋白異常表達(dá)也出現(xiàn)在直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中。故監(jiān)測β-微管蛋白在癌變過程中表達(dá)水平的變化對腫瘤治療研究以及提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，改善預(yù)后都具有重要意義。

其次，由于β-Tubulin的蛋白在大部分細(xì)胞中的表達(dá)比較恒定，因此也被廣泛用于Western?Bloting實(shí)驗(yàn)時的內(nèi)參，也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。

抗β-Tubulin小鼠單克隆抗體可以通過與β-Tubulin的特異性結(jié)合再加上相應(yīng)熒光標(biāo)記或酶標(biāo)二抗共同作用對β-Tubulin進(jìn)行染色來觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，或者檢測實(shí)驗(yàn)樣品中β-Tubulin的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)整上樣量，確定上樣量相等，進(jìn)而比較不同條件下或者不同組織中目的蛋白表達(dá)量變化。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種β-Tubulin的單克隆抗體，但一直以來都需要表達(dá)量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的β-Tubulin的單克隆抗體對于臨床診斷和科學(xué)研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、用于科研或臨床、可用于科研或臨床免疫組化檢測β-Tubulin表達(dá)、Western?Bloting實(shí)驗(yàn)時的內(nèi)參、以及免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)的小鼠抗人β-Tubulin單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

（1）根據(jù)β-Tubulin的基因序列（NM_006086.3）的編碼框，設(shè)計1對特異引物，Trizol?Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增β-Tubulin基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28a-β-Tubulin，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并親和純化蛋白作為抗原。

（2）采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備β-Tubulin單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。