[發明專利]分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法

無效

• 申請號: 201210299397.X
• 申請日: 2012-08-21
• 公開（公告）號: CN102809595A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 談學海;林佩元;陳景才;范柳
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術，特別涉及一種分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法。

背景技術

Nav1.5鈉通道是主要的心肌電壓門控鈉通道，又稱快鈉通道。在人類心肌細胞上鈉離子通道的密度最大，高密度分布的鈉離子通道對正常沖動的形成和傳播有重要意義。INav1.5密度及動力學的改變可干擾傳導和延長復極。

研究表明，LQT綜合癥，Brugada綜合癥，進行性心臟傳導障礙(progressive?cardiacconduetion?defect，PECD)，病態竇房結綜合癥等多種心臟疾病與心臟鈉離子通道有關。

心血管疾病的開發過程中，觀察對Nav1.5鈉通道的拮抗作用已成為協助評價藥物效應的重要手段。膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”，是研究離子通道的最重要的技術。分離心臟的心室肌細胞用全細胞膜片鉗方式記錄Nav1.5鈉通道用以評價藥物的影響已成為藥物開發過程中的重要環節。

常規的心肌細胞分離的方法和手段包括膠原酶的消化和復鈣的過程。這種傳統的分離方法存在操作復雜，細胞收獲率及成活率低等缺陷；細胞外灌流液中直接取消了鈣離子，造成細胞存活時間明顯縮短等缺陷，需要進行改進和提高，從而確保實驗的成功率和穩定性。

發明內容

本發明的目的，在于克服上述現有技術存在的缺陷，提供一種易操作、能提高細胞收獲率和成活率的分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法。

本發明的目的是這樣實現的：一種分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法，包括以下步驟：

A、將豚鼠猛擊頭部致昏迷后，開胸快速取出心臟；

B、將豚鼠心臟置于4℃的正常臺氏溶液中去除脂肪和心包膜，分離主動脈并插管，置于Langendorff裝置上保持溫度37℃以6-8ml/min的速度進行離體心臟灌流：先以正常臺氏溶液灌流5min，完全沖洗心臟內殘留的血液，再用無鈣臺氏溶液灌流5min，至心臟完全停止搏動，再用50ml酶解液循環灌流8-10min，至心臟流出液拉絲明顯，膨脹變大，顏色變淡時，再用Kraft-Brühe溶液灌流5min(5分鐘的Kraft-Brühe液的灌流可以充分清洗組織中殘留的膠原酶)；

C、將心臟從Langendorff裝置上取下，剪去心房和基底部組織，將心室肌組織剪成1.5-2.5mm碎塊，用粗開口吸管緩慢吹打使心室肌細胞從心肌碎塊上分離；

D、將分離出的心室肌細胞置于37℃水浴鍋中振蕩1-2min，得到細胞混懸液；

E、將細胞混懸液用200目的濾網過濾，心室肌細胞收集于Kraft-Brühe溶液中，室溫下靜置穩定0.5-1h后備用；

F、將收集于Kraft-Brühe溶液中的心室肌細胞加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺上，靜置后心室肌細胞沉底貼壁，用細胞外灌流液清洗細胞，流速保持1-1.5ml/min；選擇邊緣整齊，表面無顆粒，橫紋清晰，無收縮的心室肌細胞進行膜片鉗實驗，采用標準的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄Nav1.5鈉通道電流；實驗在22-25℃下進行，使用的玻璃電極充滿細胞內灌流液，電阻為3-5MΩ。

上述分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法，其中，步驟B中所述的正常臺氏溶液由NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH調節pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，KCl的濃度為5.4mM，MgCl₂的濃度為1mM，CaCl₂的濃度為1.8mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM；溶液的滲透壓為290mOsm；

上述分離豚鼠心室肌細胞記錄Nav1.5鈉通道電流的方法，其中，無鈣臺氏溶液由NaCl、KCl、MgCl₂、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH調節pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，KCl的濃度為5.4mM，MgCl₂的濃度為1mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM；溶液的滲透壓為290mOsm；