[發明專利]H5N1亞型禽流感病毒反轉錄環介導的體外等溫擴增檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201210298698.0
• 申請日: 2012-08-21
• 公開（公告）號: CN103290140A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 秦智鋒;孫潔;盧體康;曾少靈;林慶燕;呂建強;楊俊興;劉建利;花群義;廖立珊
• 申請（專利權）人: 秦智鋒
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉杉;劉菁菁

技術領域

本發明涉及病毒的檢測方法和檢測試劑盒，特別是涉及H₅N₁亞型禽流感病毒環介導的體外等溫擴增檢測方法和試劑盒。

背景技術

禽流感病毒血清亞型眾多，抗原變異性強，宿主范圍廣泛，亞型之間無交叉保護性，使得禽流感頻繁暴發，成為養禽業的一大毀滅性疫病。尤其是高致病力禽流感H₅N₁亞型可導致高達100%的發病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡，其生態學和公共衛生學意義已引起全世界人們的高度重視。H₅N₁亞型禽流感病毒的快速檢測是流感防控的重要一環。目前，有關H₅N₁亞型禽流感病毒的檢測方法較多，快速、靈敏、特異的分子生物學檢測技術已經在禽流感的病毒檢測中發揮了重要的作用，但均需要復雜的儀器(如PCR儀)，在一些基層的實驗室很難進行操作。如何能夠在最先接觸疫情的基層實驗室，不需要昂貴的儀器即可對H₅N₁亞型禽流感病毒實現快速分子生物學檢測，是目前需要解決的迫切問題。

環介導的體外等溫擴增技術（Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是2000年報導的一種新穎核酸擴增技術（Notomi?et?al.,2000）。該技術針對DNA靶序列的6個區域設計4條特異引物，包含1對內引物和1對外引物，內引物包括前內引物FIP（Forward?inner?primer）和后內引物BIP（Backward?inner?primer），外引物包括F3和B3，如圖1A所示。FIP由2條引物組成，分別是F1C（靶基因F1序列的互補序列）和F2（與靶序列序列相同），TTTT鏈接F1C和F2，同理BIP由B1C-TTTTB2構成，TTTT作為連接核苷酸可有可無，當形成的環不夠30個核苷酸時，增加4個核苷酸可增加環的長度。外引物B3和F3識別區域位于內引物外側，分別與靶序列B3C、F3C互補。設計引物時還注意一個原則，擴增區段F2－R2最好控制在200個核苷酸以內。LAMP法擴增的機制（如圖1B所示）：1、引物BIP中的B2（B2c的互補序列）與模板DNA中B2c結合，起始互補鏈的合成；2、B3（B3c的互補序列）與B3c結合，啟動鏈置換反應；3、鏈置換反應產生1對雙鏈和1條單鏈，單鏈兩端有互補核苷酸，形成啞鈴狀；4、引物BIP中的B2與雙鏈莖環結構DNA的環上的B2c合成一種有缺口的過渡性莖環結構DNA；5、在過渡性莖環結構的莖上含有1對反向互補序列，在對面的末端，通過FIP形成1個環狀結構;6、在其中加入環引物FLOOP和BLOOP可以大大增加反應效率.在隨后的自我引物置換延伸合成過程中，在內引物作用下，開始循環反應，莖的長度和環的個數都逐漸增加，最后的產物為不同長度的莖環DNA組成的混合物。

擴增產物可以通過3種方法來判斷：1、瓊脂糖凝膠電泳；2、擴增產物中加雙鏈DNA染料PicoGreen；3、肉眼觀察擴增負產物焦磷酸鎂白色沉淀。LAMP法具有許多其他PCR方法無法比擬的優點。1、只需要保持60℃－65℃的恒定溫度就能進行擴增反應，因此無需昂貴的設備，一般的恒溫裝置如水浴鍋或恒溫箱就能滿足擴增要求；2、針對靶序列的6個區段設計4條引物，擴增的特異性比其他的PCR方法進一步提高；3、整個擴增在1h左右即可完成，且產率可達到0.15mg/mL，擴增效率大大提高。4、進行RT-LAMP時，在增加反轉錄酶和RNA酶抑制劑后，不需要專門設計反轉錄的時間，整個反應的時間也不需要增加，進一步提高檢測的效率；5、在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg²⁺結合，產生副產物――焦磷酸鎂沉淀，由于擴增效率高，產生的焦磷酸鎂沉淀多，用肉眼觀察或濁度儀檢測濁度就能夠判斷是否擴增。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種H₅N₁亞型禽流感病毒的反轉錄環介導的體外等溫擴增（RT-LAMP）檢測方法。

本發明的另一目的在于提供一種H₅N₁亞型禽流感病毒的檢測試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

H₅N₁亞型禽流感病毒的檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括一對外引物、一對內引物及一對環引物，