[發明專利]柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙

無效

• 申請號: 201210298311.1
• 申請日: 2012-08-21
• 公開（公告）號: CN102866253A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 劉利華;朱祥枝;陳軍;甘云;陳玉妹
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于農學門類，植物保護學科，具體涉及柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙。

背景技術

柑橘黃龍病是世界柑橘生產上一種毀滅性病害，被各個國家列入檢疫性病害。引起該病害的病原是一種稱為韌皮部桿菌的限韌皮部生長的內生細菌（Cadidatus?Liberibacter?sp.）。目前已經知道柑橘黃龍病有亞洲種（Candidatus?Liberibacter?assiaticus）、非洲種(Candidatus?Liberibacter?africanus)和美洲種（Candidatus?Liberibacter?amerinus）三個種。在中國發生的黃龍病是由亞洲種病原引起的。

柑橘黃龍病可以通過接穗、苗木和介體木虱（亞洲木虱，Diaphorina?citri，非洲木虱，Trioza?erytreae）傳播。黃龍病病原菌在自然界的寄主植物種類較多，能侵染各類柑橘品種包括寬皮橘類、橙類、柚類、檸檬類等品種，目前未發現免疫品種。柑橘木虱的其它寄主還包括九里香（Murraya?paniculata）、黃皮（Clansena?lansium）等13種蕓香科植物。由于至今還沒有根治柑橘黃龍病的技術方法，綜合防控是目前防止黃龍病蔓延的主要和比較有效的方法。即：消除病源，及時鏟除果園黃龍病病株和撲殺木虱。準確診斷、及時銷毀黃龍病病株，是綜合防控成功的關鍵技術之一（劉利華等，?2010；Bové,?2006）。

目前柑橘黃龍病病原菌的檢測方法主要有：病葉組織超薄切片電鏡下檢查病原菌的方法、單克隆和多克隆抗體的免疫學方法（如ELISA），以及PCR等分子生物學檢測方法等（Garnier?M.,?1991；Gao?S，et?al.,?1993；李德望，1992；田亞南等，1998）。

超薄切片技術和電鏡黃龍病病原菌檢查的方法雖然可靠,但是該方法樣品制備過程復雜，需要一般實驗室不具有的超薄切片機、透射電子顯微鏡等精密儀器，而且病原檢出率不高。單克隆和多克隆抗體等免疫學檢測方法，根據已報道的研究結果，這些方法存在不同寄主和不同地域病原的專化性等問題。?PCR方法是目前實驗室廣泛用于檢測黃龍病病原的技術，但是檢測樣品量也十分有限，一般每人每天能夠檢測10個樣品，檢測結果最快需要2天才能夠獲得。檢測黃龍病病原菌的電鏡方法、免疫學方法和PCR方法，都需要專業人員在實驗室借助儀器設備才能夠完成。

除上所述黃龍病病原菌檢測方法外，還有根據柑橘病樹癥狀進行黃龍病診斷的方法、包括田間癥狀診斷和指示植物診斷方法等。果園管理不良、營養缺乏（如缺乏鎂、鋅等元素），或其它病蟲害的侵入，如柑橘碎葉病、衰退病、蟲害（如星天牛）、線蟲等因素也會引起柑橘植株葉片表現黃化癥狀，或者因為黃龍病病原與其他病原的混合侵入等導致葉片黃化。因此田間癥狀診斷方法不但需要有黃龍病經驗豐富的專業人員，也容易出現錯誤診斷。指示植物診斷方法周期太長，是早期黃龍病病害診斷的方法，現在已經不用于黃龍病的診斷。

綜上所述，目前的柑橘黃龍病病原檢測，包括免疫學、電鏡和分子生物學等方法都需要專業人員在實驗室利用驗儀器設備才能夠完成。這些方法難以滿足柑橘果園黃龍病監測的需要。

本發明就是針對柑橘黃龍病大量樣品檢測的需求，提供一種方便快捷、特異性高的檢測產品。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙。

本發明目的通過以下措施來實現：??

一、柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙的制備：通過從帶有柑橘黃龍病亞洲種病原抗原的長春花寄主提取和純化病原菌抗原，用于注射免疫兔子獲得黃龍病亞洲種病原特異抗血清，純化得到柑橘黃龍病亞洲種病原抗體，制備免疫膠體金，進而制備浸泡有免疫膠體金的結合墊、噴有檢測線T-柑橘黃龍病亞洲種病原抗體和質量控制線C-羊抗兔抗體的層析膜，然后組裝檢測試紙產品。

如圖1所示（檢測試紙結構示意圖），在PVC膠版上依次黏貼層析膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水材料，從而組裝成柑橘黃龍病病原亞洲種病原檢測試紙條。

層析膜如硝酸纖維素NC180膜，膠體金結合墊如聚酯纖維膜KL20，樣品墊如SB08。

二、柑橘黃龍病亞洲種病原的檢測與黃龍病的診斷，通過采集疑似柑橘黃龍病病株的病葉，加水研磨后，將檢測試紙條的樣品端插入研磨液，顯示出2條紅色條帶的為黃龍病病株。

檢測方法具體操作如下：

（1）柑橘黃龍病檢測樣品的制備