[發明專利]實時熒光定量檢測豬鼻支原體的引物和探針

有效

• 申請號: 201210296912.9
• 申請日: 2012-08-20
• 公開（公告）號: CN102766699A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 白方方;邵國青;武昱孜;劉茂軍;馮志新;熊祺琰
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明涉及一種實時熒光定量檢測豬鼻支原體的引物和探針，特別是用于豬鼻支原體的實時熒光定量PCR檢測，屬于生物技術領域。

背景技術

豬鼻支原體(Mycoplasma?hyorhinis)是一種能夠引起豬多發性漿膜炎、關節炎、耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體。豬鼻支原體不僅在豬群中普遍存在，同時也是人類和多種動物細胞培養中常見的污染物。作為一種常見病原菌，豬鼻支原體通常由母豬或大豬傳染給小豬。已有研究者證實了能從10%母豬和30%～40%斷奶仔豬的鼻腔分泌物中分離出該支原體。一旦感染，該支原體在上呼吸道迅速傳播并且能從感染豬的肺臟和鼻咽管中分離到。在英國和美國的慢性豬肺炎案例中，50%以上都能檢測到豬鼻支原體的存在；同時在地方性肺炎暴發群中幾乎每次都能夠分離到豬鼻支原體。從捷克斯洛伐克、丹麥、德國和英國分離出的幾株豬鼻支原體通過呼吸道途徑能誘發豬肺炎。豬鼻支原體的三株捷克斯洛伐克分離物和一株英國分離物,可誘導無菌小豬發生肺炎。國內寧夏農學院曾以兩株疑似豬鼻支原體（寧農3和寧農5）培養物滴鼻接種小豬，誘發輕度肺炎。臺灣林俊宏用豬鼻支原體分離株ATIT-1、3、7混合物氣管內注射可以誘發部分攻毒豬發生典型的豬支原體肺炎病變，并成功從大部分攻毒豬肺中分離到豬鼻支原體。另外，研究表明，豬鼻支原體與人類的腫瘤發生有關。

迄今為止，對豬鼻支原體的檢測方法有培養法、血清學檢測方法等，而對豬鼻支原體檢測主要以分離培養為主，所需要的時間較長，亟需建立一種敏感性高的、快速的、等量的分子生物學檢測方法。本發明提供了豬鼻支原體實時熒光定量PCR的引物和探針，有助于快速、定量診斷豬鼻支原體的感染。

發明內容

技術問題

本發明的目的是為了克服現有的以分離培養為主對豬鼻支原體檢測的時間長、無法準確定量的缺陷，提供一種能快速、靈敏、準確、定量檢測豬鼻支原體的實時熒光定量PCR檢測方法。

技術方案

一種快速檢測豬鼻支原體的熒光定量PCR引物和探針，

引物1：P37-F??5′-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3′

引物2：P37-R??5′-TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3′

分子信標探針：5’-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3’

檢測過程中PCR擴增反應體系為：

反應條件為：95℃預處理10min，進行40個循環反應，每個循環反應包括95℃15s，53℃1min，于53℃時測定熒光值。

用所述的引物對和分子信標探針可以制備豬鼻支原體的熒光定量PCR檢測試劑盒。

有益效果

本發明與現有技術相比具有以下優點和效果：

1、定量準確；

2、檢測速度快，僅1小時，加上DNA提取的制備，共僅需3-4h；

3、步驟簡單；

4、可同時進行高通量的樣品檢測。

在本發明提供檢測豬鼻支原體熒光定量PCR的引物和探針，將其用于豬鼻支原體定量檢測，建立了檢測豬鼻支原體熒光定量PCR的方法，該方法的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，完全可以滿足快速鑒定診斷豬鼻支原體的要求。

附圖說明

圖1不同拷貝數陽性質粒熒光PCR擴增的動力學曲線。分別以模板數為1.0×10⁸-1.0×10¹拷貝/ml及水為陰性對照進行Taqman?PCR分析。

圖2顯示豬鼻支原體熒光定量PCR的標準曲線。針對模板數為1.0×10⁸-1.0×10¹拷貝/ml的反應體系進行Taqman?PCR分析。當豬鼻支原體個數為1.0×10¹時，檢測樣品的Ct值為34左右，即檢測下限靈敏度可達1.0×10¹拷貝/ml。繪制得到的標準曲線的斜率為-3.121，在Y軸截距為38.243，相關系數R²=0.999。

具體實施方式：

試劑包括a）DNA裂解液，b）Taq?DNA聚合酶，c）標準陽性模板，d）熒光定量反應液，其特征是：