[發明專利]殼聚糖作為佐劑在制備流感病毒減毒活疫苗中的應用

無效

• 申請號: 201210296133.9
• 申請日: 2012-08-20
• 公開（公告）號: CN102824635A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 陳則
• 申請（專利權）人: 上海生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61P31/16;A61K39/145
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽;施春花

技術領域

本發明涉及生物制品領域，更具體地講，涉及一種能夠減少流感病毒減毒活疫苗用量的佐劑。

背景技術

流行性感冒病毒(influenza?virus)是一種常見的急性呼吸道傳染病，易于發生抗原漂移和抗原轉變，并且傳染性極強，嚴重危害人類的健康和生命。疫苗接種是預防流感病毒感染的最有效的方式之一。但是，目前流感疫苗的生產能力和技術有限。在2009年-2010年的甲型流感病毒H1N1大流行期間，據世界衛生組織數據更新，到2010年11月為止，世界上有77個國家共獲得了僅僅7800萬支疫苗，而且所有這些疫苗都是在第二波流感發生之后才送到的，這遠遠難以滿足人類的需求。佐劑可提高疫苗的免疫應答水平并降低疫苗使用劑量，在疫苗中使用佐劑有可能解決疫苗供應不足的問題。因此需要研究一些新的佐劑，通過增加疫苗的免疫原性，減少疫苗免疫的劑量，從而擴大免疫的人群。但是目前批準的應用于人體上的佐劑只有鋁佐劑和MF59兩種，難以滿足疫苗的需求。已經有研究表明殼聚糖作為佐劑能夠在動物模型中增強疫苗的系統性和局部性免疫應答。

殼聚糖廣泛的存在于自然界中，由幾丁質經過脫乙酰作用得到，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，具有無毒性、生物粘附性、生物降解性等特性，且對人體無刺激性和過敏反應，是一種安全可靠的天然活性物質在醫藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫學工程等諸多領域的應用研究取得了重大進展。美國食品藥品監督管理局已經批準殼聚糖應用于食品和藥品中。因此，殼聚糖作為流感病毒減毒活疫苗的佐劑具有重要的應用價值。

我們以前的研究《流感病毒滅活疫苗新型佐劑——殼聚糖增強免疫作用研究》（常海燕，陳建軍等，中國生物制品學雜志，2004年06期）表明將殼聚糖與流感病毒滅活疫苗混合經腹腔免疫BALB?c小鼠，間隔3周，免疫?2次。免疫后取血清，檢測血清中所產生的IgG、IgG1、IgG2a等抗體水平，同時，取小鼠鼻洗液檢測IgA抗體；加強免疫后?1周，用致死性?(40LD50?)流感病毒A?PR?8?34(H1N1)攻擊小鼠，觀察小鼠的體重變化和保護作用。結果表明，殼聚糖作佐劑能顯著增強血清抗體含量，并提高小鼠抗病毒攻擊的能力。說明殼聚糖可以作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑，增強疫苗的抗體反應。

流感病毒減毒活疫苗的免疫方式是經鼻腔免疫，目前尚沒有發現殼聚糖作為流感病毒減毒活疫苗佐劑的相關研究。殼聚糖作為流感病毒減毒活疫苗中的佐劑與作為流感病毒滅活疫苗中的佐劑，兩者作用機理不一樣，所起的效果也不一樣。與滅活疫苗相比，流感病毒減毒活疫苗最適pH值為4-5，需要調整殼聚糖溶液的相關條件比如濃度，使其能夠保證疫苗的活性，細微條件的變化，可能就會導致活疫苗失活。殼聚糖作為佐劑應用于流感病毒減毒活疫苗能夠提高粘膜抗體的產生。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是，提供殼聚糖在制備流感病毒減毒活疫苗中的應用。

本發明所要解決的第二個技術問題是，提供一種能夠減少流感病毒減毒活疫苗的用量的佐劑。

為了解決上述第一個技術問題，本發明提供了殼聚糖作為佐劑在制備流感病毒減毒活疫苗中的應用，所述流感病毒減毒活疫苗經鼻腔免疫。

作為一個優選方案，殼聚糖溶液的pH值為4-5，殼聚糖溶液的濃度是0.4g/100mL。

為了解決上述第二個技術問題，本發明提供了一種能夠減少流感病毒減毒活疫苗的用量的佐劑，所述流感病毒減毒活疫苗經鼻腔免疫，所述佐劑為殼聚糖。

流感病毒減毒活疫苗是指哺乳動物包括人預防流感病毒感染的預防性疫苗，免疫方式是經鼻腔免疫，殼聚糖作為粘膜佐劑的添加可以減少流感病毒減毒活疫苗的用量。

主要包括以下步驟：

1）殼聚糖溶液的配制：配制0.4%（質量/體積）殼聚糖（sigama）溶液。

2）流感病毒溫度敏感株的制備及生物學特性研究：從接種A/Puerto?Rico/8/34(H1N1)病毒中抽提RNA,利用RT-PCR制備cDNA，擴增流感病毒的八個基因片段。利用重疊PCR的方法分別在PB1?(K391E,?E581G,?A661T)?和PB2?(N265S)上引入突變。克隆入Phw2000質粒載體上，共同轉染293T細胞。72小時后，收獲樣本，接種10日齡雞胚，48-72小時后，收獲雞胚尿囊液，血凝實驗和基因抽提、測序驗證病毒序列的正確性。

3）使用不同劑量的流感病毒溫度敏感株在存在或不存在殼聚糖溶液作為佐劑時，研究其是否能夠抵抗同源的H1N1和異亞型的H9N2病毒的攻擊。