[發明專利]鈣網蛋白-可溶性程序性死亡受體1的融合蛋白及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201210295646.8
• 申請日: 2012-08-18
• 公開（公告）號: CN102898528A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 劉朝奇
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A61K38/17;A61K48/00;A61P35/00;A61P37/02
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

技術領域

本發明涉及DNA重組技術和蛋白質藥物領域，屬于醫藥生物技術領域，具體涉及鈣網蛋白-程序性死亡受體1融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含有該DNA序列的載體或質粒、宿主細胞，用基因工程制備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在腫瘤等疾病中的應用。

背景技術

鈣網蛋白(calreticulin，CRT)是一種高度保守的鈣結合蛋白，屬于熱休克蛋白家族，主要存在于內質網，具有多種生物學功能。CRT介導的免疫原性細胞凋亡(immunogenic?apoptosis)在抗腫瘤免疫中具有重要意義。有研究發現某些抗腫瘤治療能誘導細胞的CRT從胞內向膜表面快速轉位并在細胞膜上簇集，出現在凋亡細胞膜上的CRT可被DC細胞識別和吞噬。Obeid研究小組應用雙向電泳篩選并鑒定了一系列具有使CRT膜簇集的誘導劑，如蒽環類藥物（anthracyclines），奧沙利鉑（oxaliplatin），紫外線和γ-射線。這些誘導劑在誘導腫瘤細胞發生凋亡的同時，還使CRT從細胞內質網轉移到細胞膜并呈簇集分布。這類凋亡的腫瘤細胞具有良好的免疫原性，應用這類凋亡的小鼠腫瘤細胞接種小鼠能誘導出強大的抗腫瘤免疫活性。多數抗腫瘤藥物能誘導腫瘤細胞凋亡但不能使CRT發生膜轉位和簇集，這類凋亡的腫瘤細胞也不具備腫瘤免疫原性。但將這類凋亡細胞包被重組的CRT蛋白，則可獲得同樣的抗腫瘤免疫效應，這些結果表明CRT分子的膜簇集是凋亡細胞具有免疫原性的關鍵因素。研究發現，凋亡的腫瘤細胞膜表面簇集的CRT能作為“吞噬我(eat-me)”信號傳遞給DC，促使DC細胞活化并吞噬腫瘤細胞，DC在成熟的過程中加工并提呈腫瘤特異性抗原，從而誘導特異性CD4+和CD8+T細胞活化和增殖，由此產生對同種腫瘤的免疫殺傷活性。

程序性死亡受體1(programmed?cell?death?1，PD-1)及其配體PD-L1（programmed?cell?death?1?ligand?1）是B7-CD28家族的免疫共刺激分子，產生負向免疫調節作用，在機體的免疫穩定方面具有重要的生理功能。PD-1主要表達于活化的淋巴細胞膜表面，PD-L1與PD-1結合后誘導淋巴細胞的無能甚至凋亡，防止免疫反應的過度活化。但在腫瘤免疫研究中發現腫瘤細胞表面PDL1的高表達，它與腫瘤組織內淋巴細胞上的PD-1結合后，將抑制效應性T細胞活性，同時降低后者IL-2和IFN-γ的表達和分泌，形成腫瘤細胞免疫逃逸的微環境，促進腫瘤的生長。阻斷PD-1/PD-L1相互結合的方法可用于腫瘤的免疫治療。有學者應用PD-1胞外區（sPD-1）的原核表達蛋白或者sPD-1的真核表達質粒處理荷瘤鼠，結果發現sPD-1蛋白不僅抑制小鼠體內腫瘤細胞的生長，增強腫瘤特異性CTL細胞的功能。應用PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1途徑后，也能促進CD8+T細胞增殖和細胞因子的分泌，誘導腫瘤的消退。應用人源化的PD-1單克隆抗體進行腫瘤治療已進入臨床Ⅱ期，并取得良好的抗腫瘤效果。這些結果提示阻斷PD-1/PD-L1信號通路能達到有效的治療腫瘤的目的。

腫瘤的免疫逃逸是腫瘤得以發生、發展的關鍵因素，其中腫瘤誘導大量的免疫抑制分子構成的信號通路抑制了機體免疫系統對腫瘤組織的殺傷效應。鑒于sPD-1具有阻斷PD-1/PD-L1、促進機體對腫瘤的免疫殺傷、及將CRT蛋白特異性包被在腫瘤細胞表面具有促進腫瘤特異性抗原提呈作用；因而本發明制備了小鼠鈣網蛋白C區部分截短(Calreticulin，CRT_⊿)與可溶性程序性死亡受體1（programmed?cell?death?1，PD1）胞外段(sPD1)的融合蛋白CRT_⊿-sPD1，并在小鼠黑色素瘤細胞B16-F1中分泌表達，使sPD-1與腫瘤細胞表面的PDL1結合，阻斷PD1/PDL1信號通路，同時使CRT被包被在腫瘤細胞膜表面，使融合蛋白CRT_⊿-sPD1同時獲得兩方面的抗腫瘤免疫作用，達到有效抗腫瘤的免疫調節功能。

發明內容

本發明的目的是提供一種鈣網蛋白-可溶性程序性死亡受體1的融合蛋白及其制備方法和用途。本發明所制備的CRT_⊿-sPD1融合蛋白具有結合細胞表面PD-L1及促進淋巴細胞增殖和殺傷的活性；還能夠在體內活化、誘導免疫系統對腫瘤進行特異性的殺傷，抑制腫瘤生長、延長腫瘤鼠的生存期，可作為腫瘤免疫治療候選藥物，用于治療腫瘤等疾病。