[發(fā)明專利]一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請(qǐng)日: 2012-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN102796200A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈萍萍;蔡梅紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/70;A61K39/39
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用。

二、背景技術(shù)

Lys-His-Gly-NH₂三肽是一種可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化的激素樣物質(zhì),它不僅可以通過誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化和作用于B淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫球蛋白的多樣化性產(chǎn)生影響，而且還可以促進(jìn)機(jī)體的IgM向IgG的方向發(fā)生變轉(zhuǎn)，因其最早是從雞法氏囊中提取的，所以稱之為囊素三肽。1991年，Aydhya等發(fā)現(xiàn)囊素不僅僅存在于禽類法氏囊中，還存在于哺乳動(dòng)物的骨髓和膽管上皮細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中分離的囊素是以前囊素狀態(tài)出現(xiàn)的，它是一種序列為Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg的14肽結(jié)構(gòu)。從序列上我們可以看出其第9位、第10位和第11位這三個(gè)連續(xù)的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究還證實(shí)了此14肽的前囊素與囊素三肽有著相似的生物學(xué)活性。因此，我們可以推斷融合狀態(tài)的前囊素并不影響三肽生物活性的發(fā)揮。

近年來國外對(duì)有免疫活性的多肽的序列和結(jié)構(gòu)有詳細(xì)的研究，其中有一種叫做加加尼翁（Gagnon's?peptide）的四肽，其氨基酸序列為：Lys-Asn-Pro-Tyr。這個(gè)四肽序列被證實(shí)也是B細(xì)胞刺激物，可以增加雞新城疫疫苗等抗體效價(jià)。

為了研究重組疫苗免疫佐劑，本研究利用分子生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)了14個(gè)囊素三肽和2個(gè)加加尼翁四肽的雜合序列，并在序列的末端增加了6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列，最終序列長度為197bp，我們命名其為雜合肽囊素N197。通過合成N197的雜合多肽序列以及體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證基因工程免疫增強(qiáng)劑雜合多肽的免疫活性。

三、發(fā)明內(nèi)容

（一）本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種可廣泛用于疫苗制備，生產(chǎn)成本低，免疫佐劑效果好的新型雜合肽囊素免疫佐劑及其制備方法和應(yīng)用。

（二）本發(fā)明的技術(shù)方案是：

1雜合肽囊素N197的設(shè)計(jì)合成

14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列（Lys-His-Gly-NH₂）和2個(gè)加加尼翁活性四肽的氨基酸序列（Lys-Asn-Pro-Tyr）所對(duì)應(yīng)的密碼子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一個(gè)起始密碼子的序列（3bp）和一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)（6bp）。在序列的末端加上6個(gè)組氨酸的序列（18bp），一個(gè)終止密碼子（3bp），另外加上三個(gè)限制性內(nèi)切酶（Xho?I,Sal?I,Pst?I）的核酸序列（17bp）。這樣設(shè)計(jì)好的雜合肽囊素核酸序列共包括197個(gè)核苷酸（N197序列）。

2?含有雜合肽囊素N197序列原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

把合成好的雜合肽囊素N197序列與線性化后的PET32a(Novagen公司商品化產(chǎn)品)原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主后，用酶切鑒定的方法篩選含N197的PET32a載體的宿主菌。

3雜合肽囊素在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

以終濃度為1mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)對(duì)含雜合肽囊素序列的宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)以含PET32a空載體質(zhì)粒的BL-21菌同樣誘導(dǎo)處理后樣品為陰性對(duì)照。以SDS-PAGE電泳結(jié)果來分析雜合肽囊素在大腸桿菌中的表達(dá)水平。

4重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化

利用SDS-PAGE電泳來對(duì)雜合肽囊素N197的表達(dá)條帶進(jìn)行分離，并通過切膠回收的方法對(duì)重組雜合肽囊素N197進(jìn)行分離、純化，并可以進(jìn)一步利用SDS-PAGE電泳對(duì)切膠回收的雜合肽囊素N197的純度進(jìn)行分析。

5純化后的重組雜合肽囊素N197的體外免疫活性測定（碧云天生物公司的CCK8試劑盒）

取雞外周血，并分離出淋巴細(xì)胞，在LPS的作用下，測定純化后的重組雜合肽囊素N197在體外促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性，并設(shè)立相應(yīng)的陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

6重組雜合肽囊素N197體外免疫佐劑活性的測定