[發明專利]一種快速鑒定辣椒疫霉對丁吡嗎啉抗藥性的方法及專用引物

有效

• 申請號: 201210294998.1
• 申請日: 2012-08-20
• 公開（公告）號: CN102851363A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 劉西莉;龐智黎;陳磊;邵菁芃;李健強;覃兆海;劉鵬飛
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N9/58;C12N15/57;C12R1/645
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技術領域

本發明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關基因CesA3核苷酸點突變的鑒定及其在殺菌劑丁吡嗎啉抗性監測中的應用，具體公開一種快速鑒定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸點突變及其對丁吡嗎啉抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學技術領域。

背景技術

辣椒疫霉(Phytophthora?capsici?Leonian)是一種重要的植物病原卵菌，由辣椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是一種世界性分布的毀滅性病害，在我國普遍發生，且有逐年加重趨勢。在氣候適宜的的條件下，短期內就可爆發，蔓延速度極快，一般發病可引起30％產量損失，嚴重情況下可導致辣椒絕收。辣椒疫霉還可以侵染茄科、豆科、葫蘆科等多種作物，引起產量損失。

目前，在農業措施、抗病育種、生物防治、植物檢疫和化學防治等諸多防治措施中，化學防治仍是控制植物病原卵菌病害的主要手段，在卵菌的病害防治中發揮著不可替代的作用。以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，成為卵菌病害化學防治的里程碑，然而，目前病原卵菌對該類殺菌劑已普遍產生抗藥性，因此在生產實踐中苯酰胺類殺菌劑的使用受到限制。丁吡嗎啉(pyrimorph)是2003年由中國農業大學創制的新型殺菌劑，在中國已獲批臨時登記，用于辣椒疫病和番茄晚疫病等卵菌病害的防治。丁吡嗎啉的作用機制目前還不明確，但研究顯示該藥劑與CAA類殺菌劑具有交互抗藥性，因此，推測丁吡嗎啉與CAA類殺菌劑具有相似的作用機制。已有研究表明，與纖維素合成相關的蛋白酶cesA3是CAA類殺菌劑的作用靶標(朱書生等，2007；Blum?etal.，2010)。

迄今，尚未發現辣椒疫霉對丁吡嗎啉敏感性下降的報道。然而，每年近20,000kg丁吡嗎啉用于田間生產，且逐年增多。而且在室內條件下通過自然篩選和藥劑馴化的方式獲得了對丁吡嗎啉產生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存適合度較高，表明具有較高的抗性風險。因此，在使用丁吡嗎啉防治卵菌病害的過程中需要注意避免抗藥性的產生，加強檢測和早期預警病原菌對丁吡嗎啉的抗性發生發展情況，這有助于指導丁吡嗎啉的科學使用，延緩其抗藥性的發生和發展，延長藥劑的使用壽命。

可以用于病原菌抗藥性檢測的常規方法包括：菌絲生長測定法、菌絲干重測定法，孢子萌發測定法、瓊脂展布法和抑菌圈測定法等。但是這些方法都需要通過離體條件下分離培養獲得病原菌的純培養物，測定藥劑對病原菌的EC₅₀，借助已建立的敏感基線，比較敏感和抗性菌株的差異，試驗需要多個處理，多次重復，因此檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多。而且上述常規方法檢測靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在1％以上才能被檢測到。由于病原菌的繁殖、傳播速度一般都很快，在自然界存在的數量有很大，因此經過幾次藥劑選擇后，抗藥性病原菌亞群體可能會成為致病病原群體的主體，造成病害大流行。

隨著分子生物學技術的飛速發展及其應用范圍的不斷擴展，限制性酶切PCR、等位特異PCR分子技術開始在病原菌抗藥性檢測中應用。與傳統的檢測方法比較，不但節省了檢測時間(一般不超過4h)、提高了工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在10^-5～10^-4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。可以預測，分子檢測技術將在病害的可持續管理系統中發揮愈來愈重要的作用。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法及其專用引物對。

本發明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟：

以待測辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為168?bp的片段，則所述待測辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點；

所述突變位點指辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸為A。

所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ?ID?NO：5中自5’末端起第3365位核苷酸。

上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為58℃。