[發明專利]一種高效液相色譜梯度法測定左亞葉酸鈣有關物質的方法

有效

• 申請號: 201210294425.9
• 申請日: 2012-08-17
• 公開（公告）號: CN102841169A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 劉小柔;高媛;李勇;嚴啟新;馬春銘;王麗麗;湛常娟;馮漢林
• 申請（專利權）人: 深圳海王藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/36
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明涉及左亞葉酸鈣及左亞葉酸鈣相關制劑的分析方法，具體涉及一種用高效液相色譜梯度法進行測定的方法，屬于藥物制劑分析檢測領域。

背景技術

左亞葉酸鈣為左亞葉酸的鈣鹽，其化學名稱為(-)-N-[4[[[(6S)-2-氨基-5-甲酰基-1，4，5，6，7，8-六氫-4-氧代-6-蝶啶基]甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸鈣鹽五水合物。與5-氟尿嘧啶合用，用于治療胃癌和結直腸癌。左亞葉酸鈣的主要雜質有7種，其在左亞葉酸鈣的合成過程中生成，在儲藏過程中還有可能產生降解產物。左亞葉酸鈣與其中一種雜質二氫葉酸結構相似，在現有的檢測方法中難以完全分離；另外，左亞葉酸酸性較強，在等度分離中需加入相應的離子對試劑，存在所得主峰理論板數低，主峰與相鄰雜峰分離差、靈敏度低、色譜柱使用時間短，方法耐用性差等問題。

發明內容

為了克服上述問題，本發明的目的在于提供一種采用高效液相色譜梯度法對左亞葉酸鈣、左亞酸鈣中間體及含左亞葉酸鈣的相關制劑進行檢查的測定方法。本發明的高效液相色譜梯度法可對上述制劑中的雜質A：(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸；C：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸；D：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸；G：2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸和其它雜質進行有效的分離和含量測定。

本發明的技術方案為：

一種高效液相譜梯度法檢測左亞葉酸鈣待測樣品中有關物質的方法，其特征在于，該檢測方法包括以下步驟：

(1)制備標準品溶液，以所述標準品溶液在下述色譜條件下進行系統適用性試驗，校定檢測系統；

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠(250×4.0mm，5μm)為填充劑，以磷酸鹽緩沖液為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇(40∶60)為流動相B，梯度洗脫，柱溫為35～40℃，優選40℃，流速為0.9～1.1ml/min，優選1.0ml/min，檢測波長為280nm；

標準品溶液制備：分別取雜質A、C、D、G及左亞葉酸鈣標準品，精密稱定，加水制成每1ml溶液中分別含雜質A、C、D、G及左亞葉酸鈣各0.005～0.01mg的混合溶液；

精密量取10μl所述混合溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，校定檢測系統至左亞葉酸鈣主峰與相鄰雜質G的峰的分離度應大于1.5，理論板數按左亞葉酸鈣計算應不低于5000；

其中，所述A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氫-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，G是2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氫-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。

(2)制備供試品溶液和對照溶液

取左亞葉酸鈣待測樣品，加水制成濃度為1mg/ml的溶液，作為供試品溶液；

量取所述供試品溶液，加水制成濃度為0.01mg/ml的溶液，作為對照溶液；

(3)通過高效色譜測定待測樣品中的左亞葉酸鈣及相關物質的含量

以對照溶液注入經上述步驟(1)校定后的液相色譜儀，調節檢測靈敏度，再將供試品溶液注入液相色譜儀，在步驟(1)所述的色譜條件下進行高效液相色譜，記錄色譜圖至左亞葉酸鈣主峰保留時間的2.5倍，其中供試品溶液色譜中各雜質峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的2倍；

(4)計算待測樣品中各雜質的含量。

進一步地，上述的梯度洗脫中，流動相A比例的變化范圍為于0～20分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從90％變化為66％，流動相B的比例從10％變化為34％；于20～42分鐘，等度洗脫，流動相A的比例保持66％不變，流動相B的比例保持34％不變；于42～43分鐘，線性梯度洗脫，流動相A的比例從66％變化為90％，流動相B的比例從34％變化為10％；于43～50分鐘，流動相A和B回到初始比例，色譜柱重新平衡。

進一步地，上述磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨的一種或多種。