[發明專利]一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用

無效

• 申請號: 201210292485.7
• 申請日: 2012-08-16
• 公開（公告）號: CN102793916A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 孫黎;于蘭萍;胡永華
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P31/04;C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及疫苗學領域，具體的說是一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用。

背景技術

鰻弧菌(Vibrio?anguillarum)是一種革蘭氏陰性細菌，能感染包括蝦類、貝類和魚類等水產養殖動物，誘發危害嚴重的弧菌病。在魚類中，已發現鰻弧菌可感染多種海水和淡水魚，包括虹鱒、牙鲆、大菱鲆、鰻鱺、大黃魚等。鰻弧菌是一種條件致病菌，其誘發的弧菌病容易發生在不良的養殖環境條件下，如高溫、高養殖密度等。

在歐美，弧菌病防控多年來依靠滅活性多聯疫苗。在我國，目前還沒有商業化鰻弧菌疫苗。已報導的實驗室鰻弧菌疫苗主要包括滅活疫苗和亞單位疫苗，尚無減毒疫苗。減毒疫苗是通過對病原菌株人為突變，隨后篩選毒力降低的突變株而獲得。減毒疫苗的優點是能夠通過細菌自身殘留的毒力入侵宿主，從而模擬自然感染，誘發強大的宿主免疫反應。基于這一特點，許多減毒疫苗可通過浸泡和口服的方式傳遞，從而避免了昂貴的注射途徑，因此在應用上有很好的市場價值。

發明內容

本發明目的在于提供一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種鰻弧菌減毒疫苗,減毒疫苗菌株為鰻弧菌C312在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為100ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株C312RM。

將鰻弧菌C312在含有1.5ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天，挑取轉化子，將轉化子在含有3ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天選取轉化子，將轉化子在含有6ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天選取轉化子；如此重復，直至LB培養基中利福平濃度達100ug/ml，由此獲得的轉化子即為減毒疫苗菌株C312RM。

所述減毒疫苗菌株C312RM與海藻酸鈉微球按體積比1：1.67混合，作為海豚鏈球菌免疫口服藥物；或將減毒疫苗菌株C312RM于LB培養基中培養至OD₆₀₀=0.8-1離心沉淀于海水中重懸作為海豚鏈球菌免疫浸泡藥物。

本發明具有如下優點：本發明的疫苗可經由口服或浸泡方式傳遞，因此避免了常規的注射傳遞模式，操作簡單，成本低廉，可以廣泛用于各種養殖條件，具有良好的應用前景。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：

實施例1

鰻弧菌減毒疫苗的構建方法：

將鰻弧菌C312在含有1.5ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天，挑取一個轉化子，將轉化子在含有3ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天，挑取一個轉化子，再將轉化子在含有6ug/ml利福平的LB培養基中培養4－5天，挑取一個轉化子。如此逐漸升高利福平濃度，直至利福平濃度達100ug/ml，（在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養梯度為，1.5ug/ml、3ug/ml、6ug/ml、12ug/ml、24ug/ml、48ug/ml和100ug/ml），在此培養基中挑取一個轉化子，命名為C312RM。

所述LB組成成分按重量百分比計：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化鈉,97.5％蒸餾水。

所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCC?No.6250，保藏日期2012.6.21，分類命名為鰻弧菌(Vibrio?anguillarum)。

實施例2

C312RM毒力檢測：用半致死量（LD₅₀）測定方法（具體方法參見文獻Wang?H,Hu?Y,Zhang?W,Sun?L.Construction?of?an?attenuated?Pseudomonas?fluorescens?strain?and?evaluation?of?its?potential?as?a?cross-protective?vaccine.Vaccine2009;27:4047－55）檢測C312RM與野生株C312的毒力，發現野生株C312的LD₅₀為10⁶CFU，而減毒轉化子C312RM的LD₅₀為1.5x10⁸CFU。因此，較之于野生株C312,減毒轉化子C312RM的毒力大幅下降，是一株減毒株。

實施例3