[發明專利]基于Taqman-ARMS技術檢測基因突變分型的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201210291849.X
• 申請日: 2012-08-16
• 公開（公告）號: CN102776291A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 王弢;秦勇
• 申請（專利權）人: 蘇州工業園區為真生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.基于Taqman-ARMS技術檢測基因突變分型的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）根據目的基因的突變位點設計ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點，并將位于突變位點上游第1-3位核苷酸中的任一位錯義突變；

（2）根據所述突變位點設計Taqman-MGB探針，所述Taqman-MGB探針特異識別ARMS引物的擴增產物正義鏈突變位點的Taqman探針，所述探針的3’端結合有小溝結合分子；

（3）提取模版DNA，利用步驟（1）所得引物對和步驟（2）所得探針對模板DNA進行熒光定量PCR檢測。

2.根據權利要求1所述基于Taqman-ARMS技術檢測基因突變分型的方法，其特征在于：將所述突變位點上游第1位核苷酸中的錯義突變。

3.根據權利要求2所述基于Taqman-ARMS技術檢測基因突變分型的方法，其特征在于：所述步驟（1）中，所述突變位點為EGFR基因2573位錯義突變，所述ARMS引物為SEQ?ID?No：3和SEQ?ID?No：5所示的核苷酸序列。

4.根據權利要求1-3任一項所述基于Taqman-ARMS技術檢測基因突變分型的方法，其特征在于：所述步驟（2）中，所述Taqman-MGB探針為SEQ?ID?No：9所示的核苷酸序列。

5.權利要求1-4任一項所述方法使用的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括檢測目的基因的突變位點的ARMS引物和Taqman-MGB探針，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點，并將位于突變位點上游第1-3位核苷酸中的任一位錯義突變；

所述Taqman-MGB探針為特異識別ARMS引物的擴增產物正義鏈突變位點的Taqman探針，所述探針的3’端結合有小溝結合分子。

6.根據權利權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述ARMS引物為SEQ?ID?No：3和SEQ?ID?No：5所示的核苷酸序列。

7.根據權利權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述Taqman-MGB探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No：9所示。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由PCR?緩沖液、dNTPs、引物對、Taqman-MGB探針、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA組成，各組分反應時終濃度為：

PCR緩沖液???????????????終濃度0.5～2.5×；

dNTPs??????????????????????0.?1～0.75mM；

引物對?????????????????????上、下游引物終濃度分別為150～350nM；

模板DNA?????????????????0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶?????????0.01～1.0U/μL；

MgCl_{2?????????????????????????????????}終濃度為1.5～3.5mM；

Taqman-MGB探針??????終濃度為50～200nM。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述PCR?緩沖液、dNTPs、引物對、Taqman-MGB探針、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA終濃度組成為：?

PCR緩沖液??????????????終濃度1×；

dNTPs??????????????????????0.25mM；

引物對?????????????????????上、下游引物終濃度分別為250nM；

模板DNA????????????????0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶?????????0.01～1.0U/μL；

MgCl_{2?????????????????????????????????}終濃度為2.0～2.5mM；

Taqman-MGB探針??????終濃度為50nM。