[發明專利]耐輻射異常球菌R1 trkA基因培育抗旱植物的應用

有效

• 申請號: 201210291584.3
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN102807990A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 林敏;王勁;左開井;陳明;張維;平淑珍;陸偉;燕永亮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及耐輻射異常球菌R1（Deinococcus?radiodurans?R1）trkA基因（DR1666，GeneID:1798231）的新功能，具體涉及該基因在增強植物抗旱抗性方面的應用。?

背景技術

鉀元素是植物必需的三大礦質元素(N、P、K)之一，對植物體具有重要的生理作用。當植物受到鹽脅迫時，大量Na⁺從根部進入植物體內，使K⁺的吸收受到抑制，形成低的K⁺/Na⁺比，從而對植物造成傷害。在這種情況下，如果能夠調節植物體內K⁺/Na⁺平衡，就能抵御過量的Na⁺對植物造成的傷害。?

HKT(high-affinity?K+transporter)基因家族轉運蛋白具有可以調節植物體內K⁺/Na⁺平衡的能力，廣泛存在于植物、真菌、真細菌和古細菌中。耐輻射異常球菌R1（D.radiodurans?R1）含有2個HKT類蛋白，與植物Na+轉運關系密切密切相關，對長期的干燥和強氧化脅迫具有極強的抗性。?

鉀是植物體必需的營養元素之一,鈉是植物生長的功能元素,對于大多數植物而言,少量有益,過量則會產生毒害。植物對它們的吸收主要靠其體內的通道蛋白和轉運載體。植物HKT轉運蛋白與真菌Trk轉運蛋白、原核生物的KtrB和TrkH的K轉運蛋白的聯系緊密,真菌中Trk轉運蛋白是低K濃度下主要的K吸收系統。大多數植物中都可能存在HKT轉運蛋白,這個基因家族并不是很大,在擬南芥中該家族只有一個成員。序列分析推測,這個家族的轉運蛋白可能由細菌的2次跨膜結構的K通道進化而來,形成現在的8次跨膜和4個圈的一孔結構蛋白。HKT家族基因主要分為2個亞家族,亞家族1成員是特異性的Na低親合轉運蛋白,大部分分布于根系中柱的細胞質膜上,尤其是木質部薄壁細胞膜上,負責從木質部汁液中重新獲取Na而阻止其向地上部的運輸;而亞家族2成員是K/Na高親合轉運蛋白,尤其在K缺乏條件下負責對Na的吸收從而促進作物的生長,主要分布于根系的皮層和內皮層細胞膜上。?

Deinococcus?radiodurans（D.radiodurans）是至今已知生物中最高的輻射抗性的生物之一。該菌具有對致死劑量的電離輻射、UV輻射以及DNA損傷試劑的極端抗性，能將電離?輻射造成上百個DNA雙鏈斷裂的基因組完整恢復如初，且不發生突變的能力。其極端的耐輻射能力及其DNA損失修復分子機制引起科學界的極大興趣，不僅對探索DNA修復分子機理的基礎學科有著十分重要意義，而且對促進新的DNA技術的發展以及在環境保護和生物修復、人類健康、生物技術，乃至地外空間的開發和利用等方面的具有極大潛在應用前景。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了D.radiodurans基因組全序列（White1999）。?

盡管已知D.radiodurans?R1耐輻射菌株中trkA編碼的蛋白屬于HKT類蛋白成員，可能與植物Na+轉運在進化上具有協同性，但目前未見trkA在增強植物抗旱抗性功能方面的研究報道。?

發明內容

本發明的目的是從D.radiodurans?R1基因組中發現能夠增強植物對高鹽的抗性基因。并將該基因轉入植物，使轉入該基因的植物獲得耐鹽的能力。?

本發明通過如下研究，首次發現，SEQ?ID?NO:1所示序列的高親和鉀離子轉運體Deinococcus?radiodurans?R1?trkA基因（DR1666，GeneID:1798231）具有抗干旱脅迫的功能，可用于培育抗干旱性狀的植物：?

1、獲得含有D.radiodurans?R1?trkA基因（DR1666）的重組工程菌株?

1）通過PCR方法，從D.radiodurans?R1（DSM20539）菌株基因組擴增出D.radiodurans?R1?trkA基因（DR1666），基因序列號為：GeneID：1798231。其大小為681bp，該基因編碼226個氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構建了含有完整trkA基因的重組質粒pGEMT-trkA；?

2）將trkA基因（DR1666）連接于pRADZ3穿梭質粒上，該質粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子，構建含有groEL啟動子的完整trkA基因（DR1666）重組質粒pRADZ3-trkA?G；?