[發(fā)明專利]一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210291443.1
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN102807988A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖飛;黃薇;王大光
• 申請（專利權(quán)）人: 北京翔達盛吉科技咨詢有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/70;C12N9/10;C12Q1/52;G01N33/573
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11003
• 代理人: 張飆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和蛋白表達領(lǐng)域，涉及一種用生物工程技術(shù)高效制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，產(chǎn)物可作為抗原物質(zhì)進行動物免疫，篩選相關(guān)抗體，同時為臨床化學診斷所需校準品、標準物質(zhì)和參考品的制備開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

背景技術(shù)

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate?aminotransferase?AST)，原名谷草轉(zhuǎn)移酶(glutamic?oxaloacetic?transaminase?GOT)，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，在體內(nèi)各組織中廣泛存在，AST以心臟活性最高。正常人血清中含量甚微。正常情況下，血液中來自肝細胞的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的范圍是0-40U/L（單位）。

當心肌細胞受到損傷，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶會大量釋放到人體血液中，導致血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高；當肝細胞受到損傷時，同樣會檢測到血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的值升高。肝內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶有2種同工酶，分別存在于肝細胞的線粒體（mAST）和胞漿內(nèi)（sAST）。在肝細胞輕度病變時，僅sAST釋放入血；而當病變嚴重時，mAST也會相繼釋放入血。故血清AST活性隨肝細胞損害的程度增高。

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是肝功能檢查里重要的一項，可以檢驗肝組織是否受損。在肝功能檢查中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶是反映肝細胞受損的指標，而天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是反映肝細胞壞死的標準。對于肝硬化、肝纖維化、肝癌的檢測非常準確。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶可以和谷丙轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合起來反映肝功能的狀況，比如谷丙轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比值均在1.0以下為肝硬化或早期肝硬化患者。

我國幅員遼闊，人口眾多，臨床診斷試劑市場巨大，前景廣闊。就國內(nèi)的現(xiàn)狀來說，我國的診斷試劑行業(yè)仍處于成長初期，即產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)的投入初期，成長期還沒有真正到來，而我國診斷試劑市場規(guī)模約為全球市場的1／14，有較大的成長空間。研制價廉物美的診斷試劑產(chǎn)品無疑是非常必要且具重要意義的。

目前國外的產(chǎn)品通常是把試劑、參考品（校準品、質(zhì)控品）、儀器作為一個系統(tǒng)（封閉系統(tǒng)）推入市場，在檢測重復性、準確性上有很大的優(yōu)勢，并且具有市場壟斷性。國內(nèi)主要的診斷試劑生產(chǎn)廠家?guī)缀醵紱]有生產(chǎn)相應質(zhì)控品的經(jīng)驗和實力，市場上認可的國產(chǎn)產(chǎn)品寥寥無幾。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、制備成本低廉，成功率高的制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，該方法包括:

1）改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；

2）將步驟1）中改造后的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列插入表達載體中，并用大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)化表達；

3）將轉(zhuǎn)化表達菌株接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導；

4）所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；

其中，步驟1）中改造后的全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列為：

atggctctgc?tgcattctgg?tcgtgtactg?cctggtattg?ctgctgcatt?ccacccgggc

ctggccgcgg?cggcttctgc?acgtgcatcc?tcctggtgga?ctcatgtaga?aatgggtccg

ccagatccga?tcctgggtgt?taccgaggcg?ttcaaacgcg?ataccaattc?caagaagatg

aacctgggtg?tgggcgcgta?ccgtgacgac?aatggcaaac?cttacgtact?gccatctgtg

cgtaaagcag?aagcgcaaat?cgcggctaaa?aacctggaca?aagaatatct?gccaatcggc

ggcctggcgg?aattttgtaa?agcttctgcg?gaactggcgc?tgggtgaaaa?cagcgaagtg

ctgaaaagcg?gtcgtttcgt?taccgtacag?actatctctg?gtaccggtgc?tctgcgcatt

ggtgcttctt?ttctgcaacg?tttcttcaaa?ttctctcgtg?acgtgttcct?gccgaagccg

acgtggggca?accacacccc?gatttttcgc?gatgcgggca?tgcaactgca?aggttaccgc