[發明專利]一種快速高效的均一化全長cDNA文庫構建方法

在審

• 申請號: 201210291096.2
• 申請日: 2012-08-16
• 公開（公告）號: CN102797044A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 羅昊澍;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 北京諾蘭信生化科技有限責任公司
• 主分類號: C40B40/08
• 分類號: C40B40/08;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種快速高效的均一化全長cDNA文庫構建方法，屬于現代分子生物學技術領域。?

背景技術

全長cDNA文庫不僅能大大提高基因測序和生物信息學分析的進程，還利于后期蛋白質表達及功能分析，也是高效、大規模獲得基因序列信息的一條有效途徑，尤其是對基因組龐大，近期內尚不能進行全基因組測序的生物來說更是進行功能基因組研究的一條重要途徑。即使在模式生物，如擬南芥、水稻、秀麗線蟲等全基因組測序完成后，分子生物學家們仍舊構建了相應生物的全長cDNA文庫，并進行了大規模的全長cDNA測序，以深入了解基因的功能。如：擬南芥(A.thaliana)，小鼠(M.musculus)，果蠅(D.melanoga?ster)，水稻(O.sati2va)等等，產生了大量有價值的數據，由此科學家們也取得了很多全新的研究成果，極大地促進了功能基因組學研究，推動了醫學、農業和環保生物技術產品的開發。?

構建高質量全長cDNA文庫是一個技術難度大、成本高、耗時長的重要生物技術。首先，獲取完整的mRNA比較困難；其次，全長cDNA也不易得到；第三，有效區分全長和截短的基因非常棘手；第四，由于基因序列長短不同，克隆生長快慢也不一致，很容易導致小片段基因的富集。而基于普通cDNA文庫中的基因片段來獲取全長基因的方法(如RACE技術)在整個基因組范圍內大規模、高通量地發?掘新基因是難以想象的。?

此外，要想獲得高質量有價值的全長cDNA文庫，mRNA的均一化處理非常關鍵。全長cDNA文庫在一定程度上解決了大規模獲得全長cDNA的問題，但如果想通過大規模測序來發掘新基因，還有一個無法回避的現實問題就是：冗余序列。為了提高發掘稀有表達新基因的效率，還需要對全長cDNA文庫進行差減/均一化。目前有基于DNA復性動力學原理或基因組飽和雜交的方法進行cDNA文庫的均一化處理方法。前者利用DSN(duplex-specific?nuclease)特異降解mRNA/DNA雙鏈中的DNA，后者將具有互補性的基因組DNA固定在磁珠上，與文庫質粒進行雜交，收集流出組分。?

目前，在全長cDNA文庫構建方面已經取得了很大的進展，全長cDNA文庫的構建方法也不斷涌現，其中主要有：CAPture法1、Oligo-capping法2、SMART3法、以及Cap-jumping法4等。?

1.CAPture法?

CAPture法(mRNA?Cap?Retention?Procedure)利用真核生物mRNA的帽子結構和帽子結合蛋白(轉錄起始因子eIF-4e)相互作用的動力學原理來捕獲全長cDNA。首先，在反轉錄酶的作用下將mRNA轉錄為cDNA，形成cDNA/mRNA雙鏈復合體；接著，用RNaseA對cDNA/mRNA雙鏈分子進行酶切。如果反轉錄不徹底，cDNA沒有延伸到mRNA的帽子結構部位，那么靠近mRNA5＇端的mRNA將以單鏈形式存在，這種情況下，RNaseA就能將這類mRNA的帽子結構切除掉，因此這類cDNA/mRNA雙鏈復合體也就不再攜帶帽子結構。?

CAPture法采用RNAseA酶切cDNA/mRNA復合體，以除去短截的(沒有完全轉錄)復合體中mRNA5＇端的帽子結構。但RNaseA具有堿基偏愛性，它能夠有效切割富含嘧啶的單鏈RNA，而對嘌呤含量較高的mRNA消化效率卻很低，甚至不能切割。一般來說，mRNA的5＇端G+C含量普遍較高，尤其在5＇端非編碼區，這種現象更為明顯，也正是由于這種原因，致使短截cDNA摻入到全長cDNA中，導致全長cDNA在文庫中的比例下降，文庫中全長cDNA的比例不是很高(60％～70％)。?

2.Oligo-capping法?

Oligo-capping法(Oligo-capping)利用細菌堿性磷酸酶(Bacterial?alkaline?phosphatase?BAP)水解5＇端不完整的mRNA的5＇磷酸團，防止短截的mRNA在后續反應中與寡聚核糖核酸連接；接著，用煙草酸焦磷酸酶(Tobacco?acid?pyrophosphatase?TAP)除去mRNA5＇端的帽子結構，使mRNA5＇端帽子結構處的磷酸基團暴露出來；然后，用T4RNA連接酶mRNA的5＇端連上一段寡聚核糖核酸，作為引發第二鏈cDNA合成的引物結合位點，最后經反轉錄，PCR擴增、酶切、連接，建成目的文庫。?