[發明專利]一種應用多重PCR陣列技術的核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201210289505.5
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN102936593A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 杜蓬;張磊;邵世和;孫愛華;王黎芳;周海鷗;銀國利;何方;蔣錦琴;花扣珍;覃江鳳
• 申請（專利權）人: 浙江醫學高等專科學校
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及一種核酸檢測方法，特別涉及應用多重PCR陣列技術檢測核酸的方法，屬于生物技術領域。?

二、背景技術

多重PCR技術(multiplex?PCR，mPCR)是自上世紀80年代PCR技術誕生以來，該技術領域的又一大革新。傳統PCR技術僅使用一對引物，通過擴增產生一個核酸片段，多用于單一目的序列的鑒定。而mPCR是在同一PCR反應體系里應用兩對以上的引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與經典的PCR相同。?

mPCR最大的特點就是提高了檢測的效率，使PCR成為了一種高通量的手段：(1)高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種待測靶物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一個樣本就可檢測多種靶標；(2)系統性，mPCR很適宜于成組靶標，如肝炎病毒、腸道致病性細菌、性病、食品微生物及細菌戰劑等類別中不同病原體的同時檢測；(3)經濟性，多種靶標在同一反應體系內同時檢出，則在時間、試劑、費用開支等方面的耗費都是很大的節省。?

mPCR技術在生物醫學領域應用廣泛。比如多種病原微生物的同時檢測或鑒定，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。針對待檢對象的多型別，或多位點基因突變等問題，mPCR可提高其檢出率。在具體應用中，為了提高檢測的特異性，引物的設計與選擇則顯得尤為重要。同時針對多個基因靶序列進行PCR檢測，往往出現為了保證引物的特異性，而使得多對長短不一，GC含量有明顯差異的引物間Tm值難以統一的現象，給整個mPCR體系的退火溫度程序設置帶來困難，從而減低了mPCR檢測的靈敏度。本發明針對這一問題，通過mPCR技術結合通用標簽序列(universal?tag，UT)的方法，即在每條原有檢測引物的5’端加上一個自行設計的、Tm值統一的UT引物，使得多對引物在擴增中實現退火溫度的統一，提高反應的效率。與此同時，該發明還可實現多物種混合樣本、多個mPCR體系的同時實施，即mPCR陣列。總而言之，對于普通mPCR而言，本發明的主要特點是使得mPCR中多重引物的不同退火溫度得以統一，促進了反應的進行，提高檢測靈敏度。此外，由于反應體系中UT的Tm值相對普通檢測?引物偏高，使得PCR的特異性也有所提高。?

三、發明內容

本發明的目的在于提供一種核酸檢測方法，通過mPCR結合UT的方法，以提高核酸檢測的靈敏度和特異性。?

本發明的技術方案：一種應用mPCR陣列技術的核酸檢測方法?

本發明的一個目的是提供通用標簽(UT)序列，其由20-24個堿基組成，其特征在于：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過±1℃，且大于檢測引物Tm值5-10℃左右；②UT序列為隨機設計的DNA片段，與待檢測生物的核酸序列間無同源性。?

優選，所述UT序列由多組四個堿基組成的隨機四聚體，該四聚體應滿足：(1)四聚體間至少要有兩個堿基是互不相同的；(2)四聚體之間不能彼此互補；(3)四聚體不應自身配對；(4)四聚體不能由兩個重復堿基對組成。更優選，所述UT序列，其由6組隨機四聚體組成。進一步優選，所述UT序列由以下6組隨機四聚體組成：CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。進一步優選，UT序列具體是：?

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG；?

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC；和/或?

F：GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC；?

R：AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC；和/或?

F：TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC；?

R：GGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC。?

本發明的另一個目的是提供一種引物對，含有上述UT序列以及檢測引物對，其中UT序列加在每條檢測引物的5’端。?

優選，引物對是：?

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC；?

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC；?

和/或?

F：CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG；?

R：CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG；和/或?