[發明專利]分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途

在審

• 申請號: 201210287701.9
• 申請日: 2012-08-14
• 公開（公告）號: CN102776161A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 王偉;林敏;何軍光;陸偉;樓億圓;張維;吳濤;燕永亮;王林輝;陳明;劉英新;黃明春;徐京
• 申請（專利權）人: 浙江新安化工集團股份有限公司;中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;C12N1/21;C12N5/10
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 謝亮;趙德蘭

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及分離來自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的制備與用途，具體涉及從草甘膦污染土壤微生物群體DNA庫中分離的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白產物的制備與用途。

背景技術

草甘膦(Glyphosate)為內吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻斷植物體內芳香族氨基酸的生物合成，導致植物死亡。

應用化學誘變細菌產生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內的國家，草甘膦產量急劇增加還與系列轉基因抗草甘膦作物品種的選育和大面積推廣有直接的關系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因及其抗草甘膦轉基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。

抗草甘膦轉基因植物的研究開發對農業發展可起到巨大推進作用，因此，為選育新的高抗草甘膦的轉基因作物本領域迫切需要開發新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。

發明內容

本發明的目的是提供一種可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途，本發明通過從草甘膦極端污染環境中采集土壤樣品，構建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA庫，分離獲得了一種EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。

本發明通過如下技術方案實現：

一種分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，用于提高植物對草甘膦的抗性。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ?ID?NO:?2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶為如下多肽，

(a)具有SEQ?ID?NO:?2氨基酸序列的多肽；

(b)將SEQ?ID?NO:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性為25.57U/mg。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，編碼所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列選自下組：(a)編碼上述EPSP合酶多肽的SEQ?ID?NO:1的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，所述編碼EPSP合酶多肽的SEQ?ID?NO:1的多核苷酸序列選自下組的一種:

(a)??具有SEQ?ID?NO:?1中1-1335位的序列;

(b)?具有SEQ?ID?NO:?1中1-1338位的序列。

一種用于提高植物對草甘膦的抗性的載體，含有如上所述的多核苷酸。

一種用于提高植物對草甘膦的抗性的宿主細胞，含有如上所述的載體。

分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制備方法，(a)培養上述含有如權利要求7所述的多核苷酸的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有活性的多肽。

一種能與如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特異性結合的抗體。

一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟：

(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組：

(a)具有SEQ?ID?NO:?2氨基酸序列的多肽；

(b)將SEQ?ID?NO:2氨基酸序列經過一個到二十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；

(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；

(3)選擇出轉入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；

(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。