[發明專利]一種昆崳林蛙改造體抗菌肽及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210287505.1
• 申請日: 2012-08-13
• 公開（公告）號: CN102786583A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 王義鵬;于海寧;秦松
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;A61K38/10;A61K8/64;A61P39/06;A61Q19/08
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體地說是一種昆崳林蛙（Rana?kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體抗菌肽Kunyuenin-3及其制備方法和應用。

背景技術

自由基指任何包含一個未成對電子的原子或原子團。生物體與外界接觸和自身產生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、脂質過氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、單線態氧和臭氧。在較高濃度下，活性氧自由基對生物細胞的細胞結構、核酸、脂類和蛋白質造成損傷。造成DNA損傷，進一步引起復制錯誤、基因組不穩定、轉錄意外起始或終止，從而導致生物體變異或疾病發生；引起細胞膜流動性和通透性改變，導致細胞結構和功能改變；引起蛋白質氧化，導致蛋白質變性和失活。

目前發現，活性氧自由基與多種人類疾病有關，如癌癥、心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類風濕性關節炎、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病和衰老等。為了抵抗活性氧自由基對機體的損害，在漫長的進化過程中生物體形成多種不同的自由基清除系統，包括非基因編碼的小分子物質，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統和谷胱甘肽酶系統；基因編碼的小分子抗氧化肽類，如從兩棲類蛙科動物皮膚中發現的各種小分子抗氧化多肽。各種不同類型的自由基清除劑在醫藥和化妝品領域具有極大的應用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。

昆崳林蛙（Rana?kunyuensis)屬于兩棲綱無尾目蛙科蛙屬，為中國特有種，僅分布于山東省煙臺市昆崳山。目前關于昆崳林蛙形態、發育和分子進化已有報道，但是關于昆崳林蛙來源抗氧化多肽的研究還沒有報道。

發明內容

本發明的目在于一種昆崳林蛙（Rana?kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體抗菌肽Kunyuenin-3及其制備方法和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種昆崳林蛙改造體抗菌肽，改造體抗菌肽為昆崳林蛙（Rana?kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體Kunyuenin-3，其是直鏈多肽，含有14個氨基酸殘基，分子量1587.97Da，等電點8.96。

所述改造體抗菌肽為：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－異亮氨酸－蘇氨酸－精氨酸－賴氨酸－半胱氨酸。

改造體抗菌肽的應用，所述所述的改造體抗菌肽用于制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的用途。

本發明的有益效果在于：本發明根據昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法設計Kunyuenin的改造體Kunyuenin-3，該改造體具有極強的抗氧化活性，此外具有分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單等有益特點。

具體實施方式

下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。

實施例1

昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆：

1）昆崳林蛙皮膚總RNA提取：

①取300mg昆崳林蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉移到EP管中，加入1m1總RNA提取緩沖液(Trizol，美國Invitrogen公司產品)，充分混勻，而后于4℃，12000rpm離心10min。

②離心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。

③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4℃，12000rpm離心10分鐘，收集沉淀用75％（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為昆崳林蛙皮膚總RNA。

2）昆崳林蛙皮膚cDNA文庫構建：采用CLONTECH公司In-Fusion?SMARTer^TM?Directional?cDNA?Library?Construction?Kit。

（1）cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)：