[發明專利]血管活性腸肽1型受體的高親和力結合多肽及其應用

有效

• 申請號: 201210287262.1
• 申請日: 2012-08-14
• 公開（公告）號: CN102796175A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 李前偉;唐波;黃定德;鄭磊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/13;G01N33/574;A61K49/14;A61K51/08;A61K103/10
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 秦力軍

技術領域

本發明涉生物技術領域，特別涉及血管活性腸肽1型受體的高親和力結合多肽。

背景技術

血管活性腸肽受體(vasoactive?intestinal?peptide?receptor，VIPR)屬于七次跨膜G蛋白偶聯受體家族，整個受體包括3個部分：N-末端胞外域，含一個疏水的N端信號肽以及VIP結合位點；跨膜域，含七個疏水的跨膜片段；C-末端胞漿域，與信號轉導相關。目前發現血管活性腸肽受體有VPAC1(血管活性腸肽1型受體)、VPAC2和PAC1三種亞型，在人體組織中，內源性VIP主要通過與VPAC1和VPAC2兩種受體亞型結合發揮生物效應，并且VIP能夠誘導VPAC1的內化和核定位，通過信號轉導調節腫瘤相關因子VEGF和EGFR等基因的表達，從而促進腫瘤生長進展。研究證實，VPAC1在結直腸癌等多種腫瘤細胞及其轉移灶中呈高水平表達，而VPAC2僅表達于良性平滑肌瘤等少數腫瘤，并且VPAC1與天然配體VIP的結合親和力是VPAC2的20倍。

目前全球結直腸癌(colorectal?cancer，CRC)的發病率和死亡率呈持續上升趨勢，已成為嚴重危害人類健康的疾病之一，針對CRC的分子核醫學顯像對于CRC的早期診斷和治療具有重要意義。由于腫瘤細胞VPAC1最大結合位點是正常組織的22.5～57.9倍，同時正常胃腸道比其它組織器官具有相對較低水平的VPAC1表達，使得VPAC1成為一潛在的CRC分子影像診斷和靶向治療的理想靶標。但目前結直腸癌VIPR分子顯像常用的分子探針主要為VIP或VIP類似物，缺乏對VPAC1的高選擇性，同時存在一定的促腫瘤增殖的風險。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種多肽，其和血管活性腸肽1型受體有高親和力。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

血管活性腸肽1型受體的高親和力結合多肽，所述高親和力結合多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，即“GFRFGALHEYNS”，氨基酸大寫字母簡寫的對照表，參照實施例。對上述物質進行了高效液相色譜和質譜分析，確定了該高親和力結合多肽，該高親和力結合多肽為如圖8所示的高親和力多肽。

進一步，所述高親和力結合多肽在N-末端引入Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-Aba進行修飾。其中，(D)指第二位的Ala為右旋丙氨酸。

進一步，所述高親和力結合多肽用^99mTc標記。其標記率為(95.86±0.83)％，比活度為(38.62±0.32)TBq/mmol。

本發明的另一目的在于提供所述多肽的新兩種應用，血管活性腸肽1型受體的含量提供了新的思路。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述的高親和力結合多肽在制備血管活性腸肽或血管活性腸肽類似物的競爭性抑制劑中的應用。通過血管活性腸肽1型受體的高親和力結合多肽與噬菌體克隆競爭抑制ELISA實驗證實，其抑制率高。

進一步，所述的高親和力結合多肽在制備結直腸癌體外診斷試劑中的應用。通過^99mTc標記多肽在動物體內分布及荷瘤動物顯像證實，該標記多肽能夠像其它多種結直腸癌分子顯像劑一樣靈敏探測結直腸癌，并且體內動力學及穩定性更優。

所述的高親和力結合多肽在制備造影劑中的應用。

本發明的有益效果在于：所述高親和力結合多肽與陽性克隆競爭結合的IC₅₀約為0.0132μmol/L，而天然配體VIP與陽性克隆競爭結合的IC₅₀約為2.7327μmol/L，表明高親和力結合多肽具有比VIP更高的親和力。所述高親和力結合多肽用^99mTc標記。所述高親和力結合多肽用^99mTc標記，其標記率為95.86±0.83)％，比活度為(38.62±0.32)TBq/mmol。

附圖說明

圖1為逆轉錄PCR結果圖。

圖2為免疫熒光結果圖。

圖3為噬菌體回收滴度曲線圖，其中Mp代表膜結合，INp代表細胞內化部分，CHO-K1代表陰性細胞結合部分。

圖4為噬菌體克隆與陽性細胞結合的ELISA分析圖，每個克隆的左側柱柱代表陽性細胞CHO-K1/VPAC1，第二條柱右側柱代表陰性細胞CHO-K1細胞，星號代表p＜0.05。

圖5為多肽VP1與陽性噬菌體克隆的競爭結合分析圖。

圖6為陽性克隆與VIP競爭結合分析圖。

圖7為所述高親和力結合多肽高效液相色譜純化圖。