[發明專利]3-吡唑基酪氨酸翻譯系統及其應用

有效

• 申請號: 201210285659.7
• 申請日: 2012-08-10
• 公開（公告）號: CN103571804A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 王江云;劉曉紅;李家松;董建樹;胡誠;龔為民;江歡歡
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/21;C12N15/11;C12P21/00;C12P21/02;C07K14/00;C07D231/12
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳曉娜

技術領域

本發明屬于生物化學領域。具體地，本發明提供氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。本發明還涉及一種3-吡唑基酪氨酸((S)-2-氨基-3-(4-羥基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸，簡寫為pyTyr)的高效合成方法及包含其的翻譯系統。更具體地，本發明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它們的配對將3-吡唑基酪氨酸定點特異插入目標蛋白質的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統，和利用所述翻譯系統在目標蛋白質中定點特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本發明還涉及用這種翻譯系統和這種方法產生的含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質，例如，含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，以及含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的應用。

背景技術

電子傳遞(Eletctron?Transfer，ET)涉及體內許多重要的生化過程，包括光合作用和細胞色素P450介導的氧化作用等。盡管目前人們在了解生物大分子如核酸及蛋白質的電子傳遞機制方面取得了巨大進步，但是對蛋白質的電子傳遞實驗仍依賴于在蛋白質本身含有的殘基如組氨酸或半胱氨酸上連接探針來進行，因此該方法僅能用于研究小的可溶性蛋白，這也就大大地限制了其應用。光誘導電子傳遞(photo-induced?electron?transfer，PET)導致的熒光淬滅是一種用來探索生物大分子中的電子傳遞機理及酶分子構象動力學等的有利工具，但由于受到目前技術的限制，缺乏新技術手段仍是將光電子轉移應用于生物功能研究中的一個瓶頸。研究者通常利用色氨酸和酪氨酸等天然氨基酸作為電子供體，熒光基團作為電子受體，因此也只能限制于研究相對簡單的生物學系統。

我們通過在蛋白中遺傳整合金屬螯合非天然氨基酸(UAAs)來克服上述限制因素。相比于在蛋白電子傳遞過程研究中作為電子供體的多種天然氨基酸以及多巴、3-氨基酪氨酸或者二氟代酪氨酸等非天然氨基酸，3-吡唑基酪氨酸-Cu(II)可以作為電子受體，這種獨特的性質使得我們可以研究復雜生物學系統中的電子傳遞過程，而這是先前的電子傳遞研究方法所不能達到的。盡管已有報道含有可以結合金屬基團(如聯吡啶，羥基喹啉等)的非天然氨基酸可以被基因編碼至目標蛋白中，但是對于它們在蛋白中發揮電子傳遞功能的應用至今卻沒有描述，而且，以上非天然氨基酸應用的最大瓶頸問題來自于其合成的復雜性，目前能夠整合至蛋白中的以上非天然氨基酸的合成至少需要五個步驟才能得到產率較低的消旋混合物，而且整個合成過程涉及到重金屬催化，致癌溶劑，強酸強堿以及多重純化步驟。本發明中，我們開發了一種高效合成金屬螯合非天然氨基酸-3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的方法，該方法僅需兩步就可以獲得較高產率(50％)的pyTyr，并且不需要經過后續復雜的過柱純化步驟即可被遺傳整合到蛋白質中。

水母綠色熒光蛋白(Aequorea?victoria?green?fluorescent?protein，GFP)目前被廣泛應用于研究生物分子定位和相互作用中，但是在水母中該蛋白的生物功能及機制至今仍在探索研究中。近期，有研究表明GFP可以作為光誘導電子供體，因此在生物體內可能通過感光進而發揮體內電子傳遞的功能。然而，由于缺乏在目標蛋白的特定位點中加入電子受體的有效方法，導致人們無法深入了解生物體內GFP的電子傳遞機制。本發明擬通過在GFP中定點特異插入pyTyr，使其通過螯合銅離子Cu(II)形成pyTyr-Cu(II)復合物，而pyTyr-Cu(II)可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發色基團產生光誘導電子傳遞，該研究將為GFP的電子傳遞機制提供研究基礎。本研究現已開發了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內位點特異性地定點插入蛋白質的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質翻譯組分，所述組分識別合適的選擇密碼子(selector?codon)從而能在體內多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，而相應的特異性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該O-tRNA。這些組分不與宿主生物體內的任何內源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對可能遺傳編碼大量結構各異的非天然氨基酸。