[發(fā)明專利]一種檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210283107.2
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102901827A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐叢劍;王宜生;堯良清;劉曉艷;李小平;孫立新;曹銳;高迎春;張蓉;金志軍;滕銀成;陸佳琦;程明軍;張曉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬分子生物學(xué)特別是糖生物學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測CA125（cancer?antigen125，癌抗原125）表面Tn抗原的試劑盒。具體涉及一種檢測CA125表面Tn抗原的的抗體-凝集素ELISA試劑盒。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開了癌抗原125是一種高度糖基化的粘蛋白,其中糖鏈部分約占整個分子質(zhì)量的20%-70%。有研究表明，約80%的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高，其水平的顯示能夠很好的反應(yīng)機體腫瘤負(fù)荷，因此，癌抗原125（cancer?antigen?125，CA125）成為目前婦科最常用的血清腫瘤標(biāo)志物以及臨床卵巢癌治療后的主要監(jiān)測隨訪指標(biāo)。據(jù)研究顯示，除了卵巢癌,血清CA125水平在許多其他良、惡性疾病中也發(fā)現(xiàn)有異常升高，如：血清CA125水平在1%左右的健康女性中有升高，在6%左右的子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、妊娠等婦產(chǎn)科良性疾病中有升高，在肝硬化、慢性活動性肝炎、急性心衰等內(nèi)科疾病以及部分胰腺癌、肺癌、肝癌等其他系統(tǒng)癌癥患者中也有升高。此外，無論良性或惡性腹水患者，其血清CA125水平都顯示有異常升高。據(jù)臨床診斷發(fā)現(xiàn)，目前婦科良性疾病出現(xiàn)了較高的發(fā)病率，如子宮內(nèi)膜異位癥在育齡婦女中發(fā)病率高達(dá)15%以上，同時其臨床表現(xiàn)如盆腔包塊、盆腔積液等與卵巢癌臨床表現(xiàn)類似，因此，致使對其的診療方案的制定帶來了困難，且給有關(guān)患者帶來不必要的精神負(fù)擔(dān)。

大量的研究表明，惡性腫瘤常伴隨著糖鏈合成、降解以及連接相關(guān)分子的異常改變，從而導(dǎo)致其合成的蛋白出現(xiàn)異常糖基化狀態(tài)。生理狀況下，所述CA125由苗勒氏管上皮，即輸卵管內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宮頸內(nèi)膜,腹膜、胸膜以及心包膜等間皮組織,支氣管上皮、支氣管粘膜下腺，以及角膜和結(jié)膜上皮合成分泌。在卵巢癌患者中，癌組織能表達(dá)高水平的CA125，并分泌入血，因此，卵巢癌患者血清中的CA125主要來源于癌組織，且具有特殊的糖基化狀態(tài)。

本領(lǐng)域研究者試圖利用上述糖基化狀態(tài)差異，區(qū)分良性或惡性疾病引起的CA125升高，從而進(jìn)一步提高臨床診斷的準(zhǔn)確性，但迄今為止，尚未見有關(guān)用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，尤其是一種用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒；本發(fā)明的試劑盒能通過包被在96孔板上的CA125抗體捕獲血清中的CA125，繼而利用特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，可用于判斷CA125升高患者是否患有惡性婦科腫瘤。

具體而言，本發(fā)明的用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒，其特征在于，其包被一種抗CA125抗體（克隆號：[X325]），通過包被的CA125抗體捕獲血清中的CA125，用糖鏈識別分子檢測CA125表面Tn抗原含量。

本發(fā)明的試劑盒的檢測原理采用雙抗體夾心法ELISA；

本發(fā)明的試劑盒的檢測對象為婦科病患者血清；

本發(fā)明的試劑盒適用人群為血清CA125水平升高的婦科病患者血清，尤其是血清CA125水平大于35U/ml的患者人群；

本發(fā)明試劑盒的糖鏈識別分子為特異性識別Tn抗原的凝集素VVA。

本發(fā)明中，所述的CA125抗體是一種糖蛋白，由于其Fc段的糖鏈有可能與凝集素發(fā)生結(jié)合，從而干擾抗原糖鏈結(jié)構(gòu)的檢測，因此，本發(fā)明的試劑盒的制備中引入了抗體糖鏈氧化衍生化處理步驟，其中：使用（4-[4-N-馬來酰亞胺]鹽酸丁酸肼）（4-[4-N-maleimidophenyl]butyric?acid?hydrazide?hydrochlorid,MPBH）作為交連劑，利用其酰肼末端與高碘酸鈉氧化糖環(huán)產(chǎn)生的醛基結(jié)合，利用馬來酰亞胺末端與半胱氨酸-甘氨酸二肽上的巰基結(jié)合，從而在結(jié)構(gòu)上破壞Fc段糖鏈，同時利用空間位阻效應(yīng)防止凝集素與其結(jié)合，最終降低抗體糖鏈所產(chǎn)生的背景信號。

本發(fā)明中，所述試劑盒的CA125抗體包被于96孔板后經(jīng)氧化衍生化處理以清除抗體糖鏈引起的背景信號；其中，所述的氧化衍生化處理中，氧化液為含20mM?NaIO₄的0.1M醋酸鈉溶液,pH5.5；衍生化試劑為溶于PBS的1mMMPBH；封閉液為溶于0.1PBST的0.1mM?Cys-Gly。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，以進(jìn)行判斷CA125升高是否為惡性婦科腫瘤的方法。