[發明專利]一種制備熱穩定疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210282409.8
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102784390A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 王廣川;秦成峰;唐?？?/a>
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K39/00;A61K47/02;C12N7/00;A61P31/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及一種基于磷酸鈣礦化制備熱穩定疫苗的方法。

背景技術

傳染性疾病對公共衛生安全造成嚴重的威脅，每年導致上百萬人的死亡。疫苗接種作為對抗傳染病最有效的醫療手段，挽救了無數人的生命。減毒活疫苗（即病毒的減毒毒株）是最為重要的一種疫苗形式，在天花和脊髓灰質炎的消滅過程中發揮了巨大作用。目前仍在臨床使用的減毒活疫苗包括脊髓灰質炎疫苗、水痘疫苗、流感疫苗、黃熱疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、流行性乙型腦炎疫苗、輪狀病毒疫苗、甲型肝炎疫苗以及腺病毒疫苗等。減毒活疫苗的活性成為（1）或（2）或（3）的病原體：（1）將病原體經過化學處理后，使病原體的毒性減弱但抗原性基本保持；（2）將病原體進行基因改造，使病原體毒性減弱但抗原性基本保持不變；（3）直接分離或篩選得到毒性低但抗原性良好的病原體毒株。通過基因改造或分離篩選的方法，世界上已有很多疫苗株，其中部分已經商業化。

由于減毒活疫苗為典型的生物制品，具有溫度敏感性，因此運輸和保藏過程必須采用低溫環境（如冷凍）。據統計，由于儲藏或運輸不當，每年約有50%的疫苗被浪費。在缺乏廣泛可靠冷鏈基礎設施的發展中國家和不發達國家，疫苗的低溫保存仍然非常困難。疫苗的冷鏈花費占據了大部分財政支出，每年超出2億美元。尤其在發展中國家，冷鏈花費占全國疫苗總財政支出的80%以上。因此，改善疫苗的熱穩定性，制備熱穩定的疫苗具有重大價值。

現有的改善活疫苗穩定性的方法如下：（1）在液體或干粉狀態的疫苗中添加穩定劑，如重水、MgCl₂和非還原性糖；（2）在疫苗的凍干技術中，采用糖玻璃化干燥、噴霧干燥等，以增強疫苗的穩定性；（3）借助蛋白質工程技術，通過增加亞單位之間的靜電作用力，衣殼-核酸的相互作用或者引入二硫鍵的方式等來增加疫苗粒子的熱穩定性。當上述步驟都存在操作過程復雜以及保護效果有限的局限性。

發明內容

本發明的目的是提供一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及一種基于磷酸鈣礦化制備熱穩定疫苗的方法。

本發明提供了一種制備磷酸鈣包被的病毒的方法，包括如下步驟：

（1）向病毒液加入具有Ca²⁺離子的化合物，即為初始體系；所述病毒液中具有PO₄^3-離子；

（2）將所述初始體系進行孵育；

（3）離心收集沉淀，即為磷酸鈣包被的病毒。

步驟（1）的目的是使Ca²⁺充分在病毒顆粒（負電性）周圍富集,并自發礦化形成磷酸鈣礦物外殼。

所述病毒液的pH可為6.0-9.5。

所述初始體系中，所述Ca²⁺離子濃度可為10mM以上，優選為10-20mM，進一步優選為13-17mM，再進一步優選為13.05839-16.80839mM。

所述初始體系中，所述PO₄^3-離子的濃度可為0.5-1.5mM，優選為0.906mM。

所述初始體系中，所述病毒的濃度可為10⁹-10¹¹PFU/L，優選為2×10¹⁰PFU/L。

所述初始體系中，病毒、Ca²⁺離子和有PO₄^3-離子的配比可為10⁹-10¹¹PFU：10-20mmol，(優選為13-17mmol，再進一步優選為13.05839-16.80839mmol)：0.5-1.5mmol（優選為0.906mmol）。

所述孵育的時間可為2小時以上，優選為2-8小時。

所述孵育的溫度可為25-37℃，具體可為37℃。

所述步驟（2）中，在所述孵育后還包括加入磷酸鈣高親和性大分子（如聚丙烯酸）的步驟。所述磷酸鈣高親和性大分子在體系中的濃度可為1ug/mL-100ug/mL，優選為10ug/mL。磷酸鈣高親和性大分子包被在磷酸鈣外殼外，可增加磷酸鈣外殼的穩定性，同時阻止包被磷酸鈣外殼的病毒顆粒進一步聚集。

所述離心的參數具體可為：10000g-16000g、5-15min（如10min）。