[發明專利]快速檢測微量百菌清的試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201210281586.4
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102798719A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 鄧瑞廣;職愛民;胡驍飛;邢廣旭;王玲玲;張改平
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.?一種快速檢測微量百菌清的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，其特征是：吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設有偶聯百菌清的載體蛋白印制的檢測印跡，還設有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體印制的對照印跡，所述金標抗體纖維層中的金標抗體為膠體金標記的抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體。

2.?根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標抗體纖維層用吸附百菌清的金標抗體玻璃纖維棉制成。

3.?根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。

4.?根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述???????????????????????????????????????????????偶聯百菌清的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白。

5.?根據權利要求1～4任一項所述的試紙條，其特征是：偶聯時所用的百菌清載體蛋白偶聯物是由如下方法制備的：

將百菌清10mg和氟化鉀3mg溶入400～800μl乙二醇溶液中，加熱至90～100℃，攪拌反應24～30h；反應結束后將反應液冷卻至室溫，加入到5g冰水中；將產生的沉淀分離并風干，得到百菌清衍生物；用400～800μL?N,N-二甲基甲酰胺溶解百菌清衍生物，加入4mg?N,N-羰基二咪唑，攪拌反應3h，然后加入含8～15mg?載體蛋白的PBS溶液中，攪拌反應過夜；用PBS透析3天，然后離心，棄沉淀，即得到百菌清載體蛋白偶聯物，分裝后保存于-20℃，備用。

6.?根據權利要求1～4任一項所述的試紙條，其特征是：所述檢測印跡和對照印跡為平行排列的“‖”直線式印跡，或為“十十”字型排列印跡，或為“┬?┬”字型排列印跡，或為“┴?┴”字型排列印跡，或為“├├”字型排列印跡，或為“┤┤”字型排列印跡。

7.?根據權利要求1～4任一項所述的試紙條，其特征是：在吸附纖維層、金標抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護膜，在吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向吸附纖維層一側0.3～0.7cm處印制有樣品標記線。

8.?權利要求1所述快速檢測微量百菌清試紙條的制備方法，其特征是：該方法包括以下步驟：

（1）百菌清載體蛋白偶聯物的制備

采用羰基二咪唑法，將百菌清與載體蛋白進行偶聯，制備人工結合抗原，其具體步驟為：將百菌清10mg和氟化鉀3mg溶入400μl乙二醇溶液中，加熱至90～100℃，攪拌反應24～30h；反應結束后將反應液冷卻至室溫，加入到5g冰水中，將產生的沉淀分離并風干，得到白色固體百菌清衍生物；用400μL?N,N-二甲基甲酰胺溶解百菌清衍生物，加入4mg?N,N-羰基二咪唑，攪拌反應3h，然后加入含8～15mg?載體蛋白的PBS溶液中，攪拌反應過夜；用PBS透析3天，然后離心，棄沉淀，即得到百菌清載體蛋白偶聯物，分裝后保存于-20℃，備用；

（2）抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體的制備

用所得的百菌清載體蛋白偶聯物制備抗百菌清的單克隆抗體或多克隆抗體；

（3）百菌清金標抗體的制備

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體的制備

用所得的百菌清載體蛋白偶聯物在纖維素膜層上印制檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體在纖維素膜層上印制對照印跡；百菌清金標抗體用于制備金標抗體纖維層，然后依次按支撐層、吸附層和保護層組裝成試紙條。

9.?根據權利要求8所述的制備方法，其特征是：所述偶聯百菌清的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白；載體蛋白中半抗原和載體蛋白的摩爾比為200～300:1；所述PBS溶液的濃度為0.01mol/L、pH值為7～8。

10.?根據權利要求8或9所述的制備方法，其特征是：所述百菌清金標抗體是由以下方法制備的：

在沸騰的200ML、0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新配制的1～2％檸檬酸鈉8mL，反應后獲得直徑15～20nm的膠體金溶液，用0.1mol/L?的K₂CO₃調節pH值至8.5～9.5，置于2～8℃保存；以1：2000的標記比將待標記的百菌清單克隆抗體或多克隆抗體加入所得的膠體金溶液中，標記10min后加入20％的PEG10000，至PEG10000的終濃度為0.05％；4℃、1500～3000rpm離心20min，除去未結合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得百菌清膠體金標記抗體。