[發明專利]實時熒光定量RT-PCR定量檢測南方水稻黑條矮縮病植株中病毒RNA拷貝數

無效

• 申請號: 201210281579.4
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102787176A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 周彤;杜琳琳;周益軍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及水稻植株上南方水稻黑條矮縮病毒的檢測及病毒RNA拷貝數的準確定量，屬于農業科學技術領域。?

背景技術：

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern?rice?black-streaked?dwarf?virus，SRBSDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第2組的一個建議新種。主要由白背飛虱(Sogatella?furcifera)以持久性不經卵的方式傳播，可侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病。該病毒粒體球狀，基因組由10條雙鏈RNA組成。水稻各生育期均能夠受到SRBSDV的浸染，田間癥狀主要表現為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖稈有初期乳白色、后期褐色的瘤狀突起，拔節期病株莖節部數節產生倒生的氣生須根及高節位分蘗，寄主除水稻外還包括玉米及多種雜草。對水稻的產量影響很大，重病田甚至可導致無產量。近年來該病在長江下游地區蔓延發生，且呈日漸嚴重的趨勢，2009年南方水稻黑條矮縮病毒全國發生面積達300萬畝，2010年迅速上升至1900萬畝，僅湖南省就發生近1000萬畝，絕收面積8萬畝，給水稻生產帶來了巨大的損失。迫切需要建立可靠、準確的檢測方法。?

目前，植物病毒常用的檢測方法有：生物學接種實驗，血清學檢測，電鏡觀察及分子方法檢測。但由于SRBSDV與水稻黑條矮縮病毒(Rice?black-streaked?dwarf?virus，RBSDV)基因組序列同源性高，在田間癥狀、病毒粒體形態、大小及血清學等多方面特征非常相似，所以給其診斷及鑒定造成了?困難，而且傳統方法存在耗時長、操作復雜及成本高等缺陷，PCR等分子方法的敏感性高，但只能進行半定量或得出“有或無”的結論，不能準確定量病毒RNA拷貝數，使得發病機制及SRBSDV的基礎研究等受到了一定的限制。?

Real?time?RT-PCR是一種簡單有效的檢測基因拷貝數的方法，實現了PCR從定性到定量的飛躍，可精確地判斷病毒RNA的拷貝數，而且具有耗時少，靈敏性高、操作簡便、安全經濟等優點。SYBR?Green?I是一種雙鏈DNA染料，與雙鏈DNA結合后熒光強度明顯增強，在擴增體系中加入該染料即可直接實時檢測擴增產物。該染料沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，對不同模板不需特別定制，不需要設計特異性很好的探針，通用性比較好。可以通過測定擴增產物的熔解曲線來正確區分特異性與非特異性。利用已知起始拷貝數的標準品做出標準曲線后，只要獲得未知樣品的循環閾值(threshold?cycle，C_T值)，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。擁有常規PCR技術無法比擬的優點：特異性強，通過特異性引物或探針與靶標基因的特異性雜交來完成模板的鑒別，準確性很高，不易出現二聚體等非特異性產物；靈敏度更高，用能夠產生熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量，熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉移探針等方法獲得，極大地提高了檢測的靈敏度；精確性好，可以利用指數期的C_T值精確定量起始模板量，還可以檢測到單拷貝基因；快速、簡便，擴增和檢測在同一管內完成，不需要開蓋進行電泳檢測，大大減少了操作、縮短了時間，避免了交叉污染、環境污染，有效地解決了PCR污染問題；自動化程度高，將光譜技術于計算機技術結合使用，擴增和檢測是同步完成，通過計算機進行實時檢測，而且操作系統封閉。實時熒光定量PCR技術正在越來越廣泛的應用到科學研究的各個領域。?

發明內容：

本發明提供了一種檢測并準確定量水稻病株中南方水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以排除水稻黑條矮縮病毒的干擾，快速診斷出水稻植株中是否攜帶南方水稻黑條矮縮病毒并得到病毒RNA的拷貝數。?

本發明所提供的一種快速檢測并定量水稻植株中南方水稻黑條矮縮病毒的方法，是通過以下方法獲得的：?

1)根據NCBI已報道的南方水稻黑條矮縮病毒S9核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后選擇相對保守區域(尤其是與RBSDV相比)，利用EU523359.1上的對應區域通過Primer5設計引物，選擇最佳的2條引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R；?

2)?Reagent(Invitrogen)提取水稻病株總RNA；?