[發(fā)明專利]一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌及其在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210281437.8
• 申請(qǐng)日: 2012-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN102757928A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張全景;付吉明;王喬隆;劉敏;鄭秀寧;莊祎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東天力藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P39/00;C12P7/60;C12P17/04;C12R1/01;C12R1/11
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型菌種——氧化葡糖酸桿菌TL-1045及其在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，具體為其在發(fā)酵制備維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸及維生素C中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素C又稱L-抗壞血酸，它能參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)及羥化反應(yīng)，是一類重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合物，在人體內(nèi)起到必不可少的重要生理作用，如治療人類壞血病，增強(qiáng)人體抵抗力。綠色植物能夠自己合成維生素C，然而人和許多動(dòng)物由于身體肝臟中缺少古洛內(nèi)酯氧化酶，因此不能自己合成，必須從外界攝取。目前維生素C已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域。并且隨著其用途的開發(fā)和人們物質(zhì)文化生活水平的提高，對(duì)維生素C的需求量也不斷增加。

1933年，德國化學(xué)家Reichstein等發(fā)明了以化學(xué)合成法為主的萊氏法，是最早工業(yè)化生產(chǎn)維生素C的方法，但此法合成路線過長，有毒有害的中間產(chǎn)物以及有機(jī)原料消耗量多，需要生產(chǎn)商在環(huán)境污染防治方面進(jìn)行較大的投入，導(dǎo)致維生素C生產(chǎn)成本較高。七十年代初，我國首創(chuàng)了維生素C二步發(fā)酵法并將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。該法在萊氏法一步發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用混菌發(fā)酵，使山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸，工藝簡(jiǎn)單、成本低、無污染，是目前維生素C工業(yè)生產(chǎn)的主要方法。

維生素C二步發(fā)酵法，第一步是在醋酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L-山梨糖，此步發(fā)酵工藝成熟，發(fā)酵周期約為20-30?h，且轉(zhuǎn)化率很高，現(xiàn)已能達(dá)98%以上；第二步是將L-山梨糖進(jìn)一步氧化生成2-酮基-L-古龍酸，此步發(fā)酵由兩種微生物混菌發(fā)酵進(jìn)行，一種為氧化葡糖酸桿菌，俗稱小菌，另一種常采用巨大芽孢桿菌，俗稱大菌。小菌能夠轉(zhuǎn)化山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸，但其單獨(dú)培養(yǎng)生長較弱；大菌不能產(chǎn)酸，但和小菌混合培養(yǎng)，能夠顯著促進(jìn)小菌產(chǎn)酸。目前維生素C生產(chǎn)第二步發(fā)酵，發(fā)酵周期約為40-50?h，產(chǎn)物濃度約為80-95?g/L，轉(zhuǎn)化率約為80-95%。第二步發(fā)酵周期長、產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，因此是限制維生素C發(fā)酵生產(chǎn)效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

為了進(jìn)一步提高維生素C發(fā)酵的生產(chǎn)效率，近年來許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)維生素C第二步發(fā)酵進(jìn)行了研究。專利200910148114.X公開了一種維生素C第二步發(fā)酵菌種制備方法，菌種茄瓶制備過程中，先將小菌接種茄瓶，培養(yǎng)16-48?h，然后再接種大菌，繼續(xù)培養(yǎng)24-72?h，這種條件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌種活力，發(fā)酵45?h，?2-酮基-L-古龍酸可達(dá)到100?g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%左右，該方法效率有所提高，但是發(fā)酵時(shí)間較長。專利200910069697.7公開了一種在發(fā)酵過程中添加巰基化合物來取代大菌促進(jìn)小菌的生長和產(chǎn)酸，但其實(shí)際生產(chǎn)效率仍低于大、小菌混菌發(fā)酵的效率。專利200910034773.0公開了一種強(qiáng)化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，通過添加海藻糖，提高菌體對(duì)古龍酸的耐受性，發(fā)酵52?h，2-酮基-L-古龍酸可達(dá)到69.38?g/L，該方法需要添加海藻糖，海藻糖價(jià)格較高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本上升，不具有實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中氧化葡糖酸桿菌對(duì)2-酮基-L-古龍酸耐受性較差，導(dǎo)致維生素C生產(chǎn)中第二步發(fā)酵效率低下的問題，提供了一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045，該菌種2-酮基-L-古龍酸耐受性強(qiáng)，在二步發(fā)酵中轉(zhuǎn)化L-山梨糖的效率高，所得2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)率顯著提高。

本發(fā)明還提供了該菌種在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，具體為其在維生素C及其中間體2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵制備中的應(yīng)用。

發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)2-酮基-L-古龍酸耐受性越強(qiáng)的氧化葡糖酸桿菌菌株，其和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的效率越高，推測(cè)可能是2-酮基-L-古龍酸耐受性強(qiáng)的菌株解除了產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)，使得在第二步發(fā)酵過程中后期，高2-酮基-L-古龍酸濃度下，菌體生長和合成產(chǎn)物效率提高。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人通過對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347進(jìn)行反復(fù)多次紫外誘變篩選，選育得到了本發(fā)明2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌（Gluconobacter?oxydans）TL-1045（即該菌種能耐高濃度2-酮基-L-古龍酸）。本發(fā)明氧化葡糖酸桿菌（Gluconobacter?oxydans）TL-1045，已由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為：CGMCC?NO.6188，保藏日期為2012年6月6日。