[發明專利]氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料-杯【4】芳烴復合物作為探針在細胞pH檢測中的應用

無效

• 申請號: 201210279852.X
• 申請日: 2012-08-08
• 公開（公告）號: CN102816826A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 韓芳菲;徐艷梅;江德臣;秦玉;陳洪淵
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于熒光探針技術領域，具體涉及氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料-杯【4】芳烴復合物在細胞pH檢測中的應用。

背景技術

正常細胞內pH的穩定與否對于細胞活性有著重要的作用，比如細胞的生長，凋亡，離子交換以及細胞內吞作用^1-5。細胞內pH的準確測量是研究細胞內pH與細胞活性之間關系的前提。細胞內pH的監測有很多方法，包括電化學⁶，NMR⁷，吸收光譜⁸和熒光探針分析法⁹。在所有這些方法中，熒光探針分析法在細胞監測方面有很好的時空分辨率。同時熒光技術對細胞活性的干擾很小，這將有利于細胞內信息的搜集。

為了達到細胞監測的要求，熒光探針要有高選擇性，亮度，水溶性，細胞滲透性，細胞存留性以及低毒性。目前為止，還沒有哪個熒光探針可以同時滿足這些標準。目前最有效的熒光探針是2′,7′-二-(2-羧乙基)-5-(6)羧基熒光素(BCECF)¹⁰，已經被廣泛用于細胞生物學。

市場上可以購買到的乙酰甲酯化的BCECF可以分散到細胞中，并且會被內生的細胞酯酶水解成帶4-5個負電荷的熒光染料，可以穩定存在于細胞中。BCECF的pKa值為7.0，使得該探針可以檢測細胞中近中性的pH值（6.8-7.4）¹¹。盡管探針從細胞中的泄漏率已經可以得到控制，探針的泄漏仍然存在¹⁰。并且BCECF不適合用于響應pH為4.5-5.5酸性條件。為了克服這些問題，含有三個磺酸基團的8-羥基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)被合成出來^12,13。含有三個或者四個陰離子的染料在生理條件下顯示有好的細胞存留性。這種染料可以運用到很多細胞類型中去檢測細胞質的pH與酸性細胞器的pH¹⁴¹⁵。HPTS58主要缺點是細胞滲透性比較差。一般情況下會借助顯微注射、電穿孔和劃痕荷載將HPTS探針染色到細胞中，但這些操作會影響到細胞內的正常活動¹⁶。

氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料（Bodipy）類染料自1990年開始引起廣泛關注^17,18。Bodipy探針擁有很多獨特的性質，包括對光穩定、熒光量子產率高以及光譜性質可調等。一些含胺基的Bodipy衍生物已經被用于監測細胞內的pH，這些化合物在細胞中一般以非質子化形式存在時，熒光較弱。當其官能團在酸性條件下質子化后熒光大大增強¹⁹。熒光強度對于pH的依賴性由多種機理產生，比如光誘導電子轉移(PET)²⁰，光誘導分子內電荷轉移(ICT)²¹和共振能量轉移(RET)²²。盡管關于Bodipy衍生物的文章有很多并且近年來增長速度很快，就我們所知，目前還沒有介紹將Bodipy類熒光探針用于監測細胞內近中性pH的文章，這對于細胞內pH檢測起著至關重要的作用。

為了將Bodipy衍生物染料用作細胞內pH探針，我們事先研究了很多其他的染料。當pH傳感器按照化學計量法1：1結合時，有效pH響應范圍大約從pKa-1到pKa+1，所以染料的pKa值應該要接近7¹⁸。氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料-杯【4】芳烴（Bodipy-Calix[4]arene）復合物是2001年文獻報道的含有四個苯酚結構的pKa為6.5的熒光染料，它的pH響應范圍在11.53-2.53之間²³。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料-杯【4】芳烴復合物在細胞pH檢測中的應用，以填補細胞pH檢測領域的空白。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

通過對氟化硼絡合二吡咯甲川熒光染料-杯【4】芳烴（Bodipy-Calix[4]arene）復合物在細胞中的存留性以及對細胞的毒性進行了完整的實驗和研究，發現Bodipy-Calix[4]arene復合物可作為探針應用于細胞pH檢測。