[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)正己醇工程菌的構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210279050.9
• 申請(qǐng)日: 2012-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103571783A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州瑞賽科技實(shí)業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)正己醇工程菌的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

正己醇是一種重要的醫(yī)藥、農(nóng)藥和香料中間體。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它也是一種理想的液體生物燃料，其燃燒熱12402千卡/kg，比0#柴油的燃燒熱9600千卡/kg高2805千卡/kg，是未來(lái)柴油的優(yōu)良替代品，可以替代礦物燃料。工業(yè)正己醇的合成通常是采用乙烯催化控制聚合后，再水解、分離而得，還可由正己酸乙酯還原而得。

目前已能利用生物發(fā)酵法制備乙醇、正丁醇、1,3-丙二醇等低碳醇，但是利用生物發(fā)酵法制備正己醇的技術(shù)還比較少見(jiàn)。美國(guó)齊凱姆公司發(fā)明了一種間接制備正丁醇和正己醇的方法，在包含碳水化合物源的培養(yǎng)基中進(jìn)行同型產(chǎn)乙酸發(fā)酵得到乙酸酯、乙酸及其混合物，將其中一部分化學(xué)轉(zhuǎn)化為乙醇，一部分和乙醇培養(yǎng)基中產(chǎn)酸發(fā)酵制備丁酸酯、丁酸、己酸酯、己酸或其混合物，再將其化學(xué)轉(zhuǎn)化為丁醇和己醇。采用該方法，可以有70％的碳源轉(zhuǎn)化為了丁醇和己醇，但是該方法操作過(guò)程繁瑣，且正己醇選擇性并不高（丹·W·沃瑟，CN200980112342.X）。本地生物，如Clostridium?Kluyveri，已報(bào)道發(fā)酵乙醇和醋酸纖維素，不僅產(chǎn)生丁酸、己酸、H2，還產(chǎn)生正丁醇和正己醇，但是，并沒(méi)有對(duì)生物合成正己醇的酶進(jìn)行定義。張等報(bào)道了正己醇合成，通過(guò)延伸Atsumi等開(kāi)發(fā)的2-酮酸合成路徑，大腸桿菌催化從葡萄糖合成正己醇。Liao研究小組等人通過(guò)設(shè)計(jì)具有NAPH和乙酰CoA驅(qū)動(dòng)力的正丁醇人工途徑，獲得新型大腸桿菌合成細(xì)胞工廠，正丁醇產(chǎn)量可達(dá)30g/L。美國(guó)科學(xué)家通過(guò)引入六碳化合物的合成酶Bktb（?-ketothiolase），延長(zhǎng)改造正丁醇人工合成路徑，開(kāi)發(fā)出一種新型的正己醇合成細(xì)胞工廠，即乙酰輔酶A工程菌正丁醇路徑合成正己醇，大腸桿菌工程菌催化，從葡萄糖直接合成正己醇，并初步研究了己醇合成酶及其影響因素（Yasumasa?Dekishima,Ethan?I.?Lan,Claire?R.?Shen,et.al,?Journal?of?the?American?Chemical?Society,?2011,133:11399-11401）。但是目前由于Bktb酶活不高造成正己醇合成途徑碳流較低，使得合成細(xì)胞工廠產(chǎn)物仍以正丁醇為主。后期計(jì)劃通過(guò)定向改造Bktb，提高胞內(nèi)己醇前體物酮基己酰CoA和可用NADH的量來(lái)進(jìn)一步增加正己醇的生產(chǎn)。

過(guò)去一直沒(méi)有微生物能由葡萄糖合成高級(jí)醇類，現(xiàn)在研究人員已能通過(guò)基因工程手段對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造，使其能夠從葡萄糖合成長(zhǎng)鏈醇類，包括異丁醇、2-甲基-1-丁醇或3-甲基-1-丁醇。我們認(rèn)為，可以通過(guò)選擇性地操縱基因，設(shè)計(jì)微生物，以合成許多不同的燃料和化學(xué)品。本發(fā)明利用基因工程方法，將梭菌屬Fe-氫酶基因hydA（GenBank?登錄號(hào)：EU590683）和地衣芽孢桿菌β-葡聚糖酶基因lic（GenBank登錄號(hào)：AY225317）的重組基因hyd-lic插入大腸桿菌構(gòu)建了正己醇合成工程菌。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)正己醇工程菌的構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案如下：

設(shè)計(jì)引物，pUC19-hydA質(zhì)粒和pUCm-T-lic質(zhì)粒分別PCR擴(kuò)增，在連接酶作用下連接成為重組DNA的基因hyd-lic，

hyd-lic連接到載體pTE28aT7，得到質(zhì)粒pTE28aT7-hyd-lic，

質(zhì)粒pTE28aT7-hyd-lic轉(zhuǎn)化至宿主菌P.?pastoris?kM71感受態(tài)細(xì)胞中，利用YPD/G418平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵。比色測(cè)定法測(cè)定酶活。

工程菌生產(chǎn)正己醇活性檢測(cè)：收集重組菌發(fā)酵培養(yǎng)的上清液經(jīng)PEG濃縮，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，檢驗(yàn)產(chǎn)己醇活性如下:用pH3～8的醋酸緩沖液配制20%～60%的纖維素半水解物溶液，適量粗酶液，37℃反應(yīng)24h，再55℃反應(yīng)12h，然后煮沸10min，微孔過(guò)濾，HPLC以及LC-MS檢測(cè)產(chǎn)物。?????本發(fā)明制備的工程菌應(yīng)用于正己醇發(fā)酵，檢測(cè)到了正己醇的生成，工程菌酶活達(dá)83U/mL，發(fā)酵產(chǎn)物正己醇含量最高可達(dá)35g/L。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限于這些具體的實(shí)施例，而所有的實(shí)施例均按上述的操作步驟操作。

實(shí)施例1、生產(chǎn)正己醇工程菌的制備