[發明專利]一種結核分枝桿菌重組蛋白質及其制備方法

有效

• 申請號: 201210278711.6
• 申請日: 2012-08-07
• 公開（公告）號: CN102757971A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 董梅;孫彬;吳純;楊采娥;雷紅;孟祥紅;王迪
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三O九醫院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;C07K14/35;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 呂世靜

技術領域

本發明涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域，特別是涉及一種結核分枝桿菌重組蛋白質及其制備方法。

背景技術

結核病（Tuberculosis，TB）是人類最古老的傳染病之一，至今依然是單一感染因素引起死亡人數最多的疾病，嚴重威脅著人類健康。近年來隨著艾滋病的蔓延及全球人口流動速度和數量的急速增長，結核病的發病率呈上升趨勢，尤其是發展中國家貧困、落后、饑餓、人口擁擠、醫療衛生條件差等現象更使結核病難以得到控制。據WHO統計，全世界現有17.22億人感染結核病菌，每年有900萬新結核病人，其中約300萬人死于結核病。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，目前全國約有5.5億人感染過結核菌，感染率達到44.5%，高于全球1/3的感染率水平，肺結核病人600多萬，其中有嚴重傳染性的病人150萬，每年死于結核病的達25萬人。據研究，受結核菌感染的人群中，10％的人會發展為結核病。結核病還是一種人畜共患傳染病。因此，結核病的預防、早期診斷和及時治療仍是我國乃至世界高度關注的課題。

結核病是由結核桿菌引起的，主要通過呼吸道傳播，通常表現為肺部感染，而當人體抵抗力下降時，結核桿菌就迅速生長繁殖而引發肺結核，若病人的抵抗力繼續下降或得不到及時治療，結核桿菌就會通過淋巴、血液傳播到身體各器官，并在該處引起結核病。常見的有腎結核、結腦、腸結核、淋巴結核等肺外結核。但是，由于結核病是一種慢性傳染病，有些感染者歷程癥狀不明顯，因此常不引起患者注意而延誤病情。故對結核病的早期診斷對有效控制結核病，降低該病的發生率及死亡率有著重大的臨床意義。

目前常用的結核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查（AFP）以及培養法。X光常用作肺結核初步診斷，但特異性差，同時對感染有艾滋病病毒（HIV）的結核病人及肺外結核病人不適用。AFB涂片法靈敏度差（僅為20~30％），用固體培養基培養結核菌，雖然可以顯著改善檢測結果，但結核菌生長緩慢，一般得6－8周才能出檢驗報告，況且AFB涂片和培養法只能在檢測方法只能在體液中存在細菌時方能檢出，而對于不排菌的結核患者就檢測不出，故認為上述檢測方法已經不能適應臨床診斷治療及傳染病控制的要求。為此，人們就企圖利用血清學方法以快速診斷結核病。

近年來，隨著結核分枝桿菌分子生物學與蛋白組學的研究不斷發展，結核病的免疫學診斷亦有較大進展。目前已經發現、純化和重組了多種結核分枝桿菌特異性的菌體和分泌蛋白質抗原。

由于結核分支桿菌抗原的復雜性，在宿主體內表達的數量、種類或時機可能隨病人的個體免疫背景和病程而異，表現出不同的抗體譜，檢測時有的抗原不表達，未檢測出相應的抗體，有的抗體含量高,有的則低。因此，單一抗原檢測，往往檢測的靈敏度并不近如人意。目前很多研究者試圖用雞尾酒式混合抗原來提高結核病感染的診斷效果，結果表明用多種特異性抗原可以在不影響特異性的情況下獲得比單一抗原更高的敏感性。

發明內容

本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌重組蛋白，本發明的另一目的是提供該結核分枝桿菌重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。

為了實現上述目的，本發明提供了一種編碼結核蛋白的重組核酸，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供了一種結核分枝桿菌蛋白的的表達載體pET-28a--ricR-rpoB-GyrB，它是將SEQ?ID?NO.1所示所述的核苷酸序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒，其質粒圖譜如附圖2所示。將表達載體pET-28a--ricR-rpoB-GyrB導入大腸桿菌中，得到表達結核蛋白的工程菌株。

本發明利用SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備結核蛋白可以通過如下步驟實現：

1）獲得具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；

2）將該核苷酸序列導入質粒，優選pET-28a質粒；

3）將該質粒導入原核宿主細胞，優選大腸桿菌宿主細胞，更優選BL21（DE3）菌株中；

4）在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養所述宿主細胞；

5）回收、純化及復性所表達的重組蛋白。

本發明還提供包含本發明結核蛋白的組合物以及試劑盒。所述的組合物可作為檢測結核感染的試劑。所述的組合物可作為檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒。