[發(fā)明專利]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210278039.0
• 申請日: 2012-08-07
• 公開（公告）號: CN102839182A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李佳楠;湯華東;陳亞;李汝霖;陳煌
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢海特生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種重組人神經(jīng)生長因子β亞基基因，其含有6組氨酸純化位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)以及經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因和分子伴侶基因，其中所述人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因?yàn)榻?jīng)過原核生物高頻密碼子改造后的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示；所述分子伴侶基因?yàn)榻?jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示。

2.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用化學(xué)合成法合成經(jīng)點(diǎn)突變優(yōu)化的權(quán)利要求1所述的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因及分子伴侶基因，并將其克隆入pET28?a?(+)表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；

(2)將步驟(1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(λDE3)中，構(gòu)建含有重組表達(dá)載體的基因工程菌；

(3)培養(yǎng)步驟(2)所得基因工程菌至A550=0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)重組人神經(jīng)生長因子rhβNGF在該基因工程菌中表達(dá)；

(4)離心收集菌體，重懸菌體，-80℃凍存；

(5)解凍菌體重懸液，破碎菌體，分離純化包涵體蛋白；

(6)體外復(fù)性包涵體蛋白，透析后超濾濃縮；

(7)經(jīng)腸激酶切割去除分子伴侶；

(8)純化獲得所述重組人神經(jīng)生長因子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)的時間為3-4小時。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1mmol/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(4)中所用的重懸液為20mM?Tris-HCl?(pH8.0)，使用量為菌體濕重的20倍體積。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(5)中破碎菌體的方法為超聲破碎法，其中超聲破碎菌體所用功率為400W，超聲15秒，間隔15秒，作用30分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(6)中復(fù)性包涵體蛋白的方法為體外稀釋復(fù)性法，其中體外稀釋復(fù)性液中，精氨酸的濃度范圍是0.75-1.0mmol/L，pH值是8.0-9.5。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(7)中的腸激酶為帶6組氨酸純化位點(diǎn)的重組牛腸激酶。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(8)中純化的方法為鎳柱親和層析法。