[發明專利]一種家蠶核型多角體病毒P10蛋白的表達純化方法

無效

• 申請號: 201210276843.5
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102851308A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 張耀洲;張小蓓;楊波;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/94
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種家蠶核型多角體病毒P10蛋白的表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)以家蠶多角體病毒基因組為模板進行p10基因的擴增；

(b)分別雙酶切p10基因和載體，連接構建重組表達載體，轉化表達菌，構建p10基因工程菌；

(c)培養p10基因工程菌，誘導表達重組目的蛋白；

(d)純化所得重組目的蛋白。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)?具體包括：

(1)設計上游引物F1：5'-GAAGGTCGTATGTCAAAGCCTAACGTT-3'?

上游引物F2：5'-GGAGCTCATCGAAGGTCGTATGTCAA-3'

下游引物R：5'-TCAAGCTTTTAGGAGTCTGGAGGATCC-3'；?

(2)以家蠶多角體病毒基因組為模板，用所設計引物F1和R擴增特異性目的片段，PCR反應參數設計為：93℃預變性5min，98℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次；最后72℃延伸10min，回收產物；

(3)以步驟(2)的回收產物為模板，用所設計引物F2和R第2次擴增目的片段，具體程序同上，最后回收產物，得到p10基因；

如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)?具體包括：

p10基因和pET-32a(+)載體利用Sac?I和Hind?III進行雙酶切，將酶切回收的產物用ligation?high進行連接并轉化E.coli?TG1感受態細胞，挑取單菌落搖菌培養后提取重組表達載體pET-32a(+)-p10，并轉化表達菌E.coli?BL21感受態細胞，構建p10基因工程菌。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)?具體包括：

在含50?mg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃，220?rpm振蕩培養p10基因工程菌至OD₆₀₀=0.5，加終濃度為0.1?mmol/L的IPTG誘導表達，得到重組目的蛋白。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)?具體包括：

(1)將得到的重組目的蛋白上清通過0.45μm纖維素膜過濾，存放于4℃，8-10h使其產生自然沉降；3000-5000rpm離心10-15min，將上清去除，保留沉淀；

(2)將沉淀用pH8.0的20mM?Tris-500mM?NaCl緩沖液洗滌1次，用移液器輕輕吹打，將沉淀吹起，然后3000-5000rpm離心10-15min，將上清去除，保留沉淀；

(3)用pH9.0的20mM?Tris-HCl緩沖液溶解沉淀，用移液器反復吹打，然后冰上攪拌10-15min，12000-15000rpm，離心10-15min，保留上清，得到純度較高的重組目的蛋白。