[發明專利]一種微生物谷胺酰轉氨酶的分離純化方法

無效

• 申請號: 201210276705.7
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102776160A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 韓紅輝;劉明耀;陳益華;易正芳;金明飛;常忠義
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

技術領域

本發明涉及生物技術領域的分離純化方法，具體涉及一種微生物谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法。

背景技術

谷氨酰胺轉胺酶（Transglutaminase，簡稱TG，EC2.3.2.13；又稱蛋白質-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉胺酶）是一種催化酰基轉移反應的酶。TG可作為酰基受體與蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基作用，形成ε-（γ-谷氨酰）Lys鍵，從而催化蛋白質分子內、分子間發生交聯，蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解，進而改變蛋白質功能性質，提高蛋白質的營養價值，在食品、生物制藥、紡織等領域有廣泛的應用。谷氨酰胺轉胺酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，包括源自動物的谷氨酰胺轉胺酶（Guinea-pig?Transglutaminase，GTG）和源自微生物的谷氨酰胺轉胺酶（Microbial?Transglutaminase，MTG）。GTG主要從動物組織中提取，但是由于其分離純化過程復雜、來源較少、價格昂貴，極大地限制其在工業生產上的應用。

與GTG相比，MTG在應用上具有對Ca²⁺的非依賴性，對熱、pH的穩定性以及易儲藏性等優點。研究表明MTG具有與GTG類似的作用和功能，比如MTG可以催化I型膠原蛋白發生交聯，形成耐高溫的膠（Nomura?Y,?et.al;?Biosci?Biotechnol?Biochem.?2001?Apr;65(4):982-5）；可以交聯明膠，形成良好的多孔網狀物用于止血和傷口粘合（Liu?Y,?et.al,?J?Biomed?Mater?Res?B?Appl?Biomater.2009?Oct;91(1):5-16；中國專利：200780051215.4、200980131973.6；美國專利:8133484；歐洲專利：WO2012017415、EP2303344)；?MTG與明膠作用形成的交聯物不易受熱溶解，具有較好的熱穩定性（Chen?T,?Embree?HD,?et.al?;?Biomaterials.?2003?Aug;24(17):2831-41，美國專利：5,834,232）等，因此微生物谷氨酰胺轉胺酶可作為潛在醫用止血材料的交聯劑用于止血、傷口粘合等外科手術中。但是，目前市場上的MTG主要用于食品加工領域，且采用傳統分離純化工藝制備，制備過程中酶的得率、純度以及比活力都不高，仍含有多種雜蛋白，難以滿足作為醫用材料的要求。

發明內容

本發明克服現有技術的上述缺陷，創新提出了一種微生物谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，即利用分散酶在室溫條件下對鏈霉菌發酵液中的pro-MTG（MTG的前體形式）進行水解處理后得到具有活性的MTG，然后，經乙醇沉淀，結合陰、陽離子交換層析對MTG進行純化，在提高的同時，得到了高純度（>95%）和酶比活力（>20000U/g）的MTG，且提高了活性MTG得率。本發明方法分離純化得到的微生物谷胺酰胺轉胺酶符合醫用材料的要求，能夠用于醫用止血材料和粘合劑。

本發明旨在提供一種微生物谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，從茂源鏈霉菌突變菌株發酵液中獲取高純度的MTG，用作醫用止血材料和粘合劑原料。本發明中，源自微生物的谷氨酰胺轉胺酶（即MTG）屬胞外酶，主要來源于微生物中的鏈霉菌，如吸水鏈霉菌、茂源鏈霉菌等，其分子量大小在38KD左右，酶的活性中心包含有一個游離的Cys巰基。

本發明提出的一種微生物谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，包括，在鏈霉菌發酵液中加入50-200mg/L的分散酶處理；然后，經乙醇沉淀、陰離子交換層析、陽離子交換層析，再經脫鹽、濃縮、過濾、凍干后得到所述微生物谷氨酰胺轉胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺轉胺酶的純度大于95%，比活力為20000-50000U/g。

其中，所述鏈霉菌發酵液為茂源鏈霉菌STK4突變菌株發酵液；所述微生物谷胺酰胺轉胺酶的第10位氨基酸為絲氨酸或蘇氨酸；第241位氨基酸為丙氨酸或甘氨酸；第284位氨基酸為纈氨酸或者酪氨酸。

本發明中，“鏈霉菌發酵液”是指茂源鏈霉菌STK4菌株在發酵培養基中培養48-72小時后的發酵液。

本發明中，“茂源鏈霉菌STK4突變菌株”是指茂源鏈霉菌STK4野生菌株經紫外輻照誘變后產生的MTG突變菌株。

本發明中，所述陰離子交換層析步驟中，上樣緩沖液為pH7.0-?7.5的Tris-HCl緩沖液；洗脫液為0-2mol/L的NaCl溶液。