[發明專利]一種利用SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法及其專用培養基

有效

• 申請號: 201210276080.4
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102796682A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 徐平;平靈艷;楊大福;常蕾
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K1/13;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種利用SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法及其專用培養基。

背景技術

大腸桿菌是大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)的簡稱，因1885年被Theodor?Escherich發現而得名。大腸桿菌屬細菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬(Escherichia)的大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，是革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。

大腸桿菌在自然界廣泛分布，也是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，主要寄生在大腸內，大多數不致病，與人終身相伴。其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長，減少蛋白質分解產物對人體的危害，還能合成維生素B和K，并產生有殺菌作用的大腸桿菌素，惠及其寄生的宿主。

由于菌體繁殖迅速，易培養，價廉，易變異且易被檢出等諸多優點，大腸桿菌已經成為現代生物學中研究最多的一種模式生物。由于其結構簡單，大腸桿菌被廣泛用于生物化學、遺傳學、分子生物學和代謝途徑的研究，以揭示生命的奧秘。大腸桿菌對于分子遺傳學的建立和發展以及生物工程的興起均發揮了重要作用。Cohen和Boyer于1973年在大腸桿菌中創造了重組DNA技術，開創了基因工程研究的先河，使得該菌成為代謝途徑和生物機制研究最透徹的微生物之一。

由于遺傳背景清楚、載體和受體系統完備、技術操作簡單、生長迅速、培養簡單、重組子穩定和大規模發酵便宜等優點，使得大腸桿菌成為基因工程研究中最主要的原核受體菌，廣泛應用于外源DNA的克隆和擴增、原核基因高效表達和基因文庫構建等基礎研究。用大腸桿菌生產的人生長激素、生長激素釋放抑制因子、胰島素等均已經取得了成功，并成功地實現了產業化，創造了巨大的產業價值。

盡管大腸桿菌具有諸多優點，但也給人類帶來了諸多麻煩，如果控制不當，還可能引起突發事件。作為條件致病菌，在腸道中的大腸桿菌一旦離開腸道進入膽囊、尿道、膀胱、闌尾等，可引起炎癥反應。當細菌由于如潰瘍等因素導致的穿孔而進入腹腔時，通常會導致致命性的腹膜炎癥感染。大腸桿菌的某些菌株本身還具有毒性（其中一些類似導致痢疾的毒素），可以導致食物中毒，使得細胞脫水引起腹瀉等，并可引發群體的急性感染，如1996年5-8月份日本的O157：H7大腸桿菌引起的疫情，波及9000多人。不僅如此，由于許多大腸桿菌可在菌體死亡溶解后產生內毒素，對機體產生強烈的毒性，可引起宿主發熱、毒血癥、敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、腎炎等嚴重疾患，甚至休克死亡，使得大腸桿菌所致疾病的治療更為復雜。而抗藥性基因的衍變以及在菌株間的廣泛傳播，使得耐藥菌泛濫成災，難治愈，死亡率高并且極易復發，這已經成為人類臨床治療的重大難題和養禽業的重大威脅，困擾和阻滯了養殖業的發展。因此，耐藥基因及其質粒在大腸桿菌菌株間的轉殖、衍變和耐藥菌的產生、發展的系統生物學探索也同樣具有重要的生物醫學研究價值。

蛋白質是基因功能的直接執行者，且相互關聯，共同執行細胞復雜的生命活動過程。蛋白質組學是系統鑒定和定量細胞內蛋白質，并研究其功能的新興學科。大腸桿菌的蛋白質組學研究，特別是定量蛋白質組學研究可以發現、鑒別基因差異和生物學處理的效應，揭示其分子調控網絡及其分子機制。但由于技術的限制，早期大腸桿菌組學水平的蛋白質鑒定主要依靠雙向凝膠電泳，難于分清所有的蛋白質及其量的變化。近來，基于液相色譜-質譜聯用技術為簡單蛋白質組的高覆蓋奠定了技術基礎。由于質譜本身并不是好的定量工具，定量蛋白質組學研究需要定量標準。目前基于細胞培養過程中的重穩定性同位素標記氨基酸的整體蛋白質組標記技術（stable?isotope?labeling?by?amino?acid?in?cell?culture，SILAC）已經成為定量蛋白質組學研究的金標準。