[發明專利]快速檢測牙齦卟啉單胞菌致病島基因型的多重PCR方法

無效

• 申請號: 201210275907.X
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102758020A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 肖水清;王兆強;劉毅;張玉杰
• 申請（專利權）人: 肖水清
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種常見的口腔病原菌牙齦卟啉單胞菌致病島Rag基因4種基因型檢測的多重PCR方法。

背景技術

牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis，Pg）是革蘭氏陰性專性厭氧菌，能分泌大量毒力因子導致牙周組織破壞，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發性全身性系統疾病密切相關。自1999年Curtis等發現Pg致病島（pathogenicity?islands）以來，人們對Pg的致病性有了進一步的認識，致病島存在于強毒株中，一般弱毒株或無毒株中缺失。目前，rag基因座被確定是P.gingivalis的致病島。實驗證實，rag位點的失活會降低牙齦卟啉菌的致病性，減少其對牙周組織的破壞,rag位點在臨床菌株中有4種不同的基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同，rag-1型Pg對牙周軟組織的破壞性最強，為高毒力基因型；為盡快確定臨床菌株中Pg的致病島基因型，有必要建立快速、敏感的檢測方法同時檢測臨床標本中的rag基因型，以確定其對牙周組織的破壞能力，研究牙周病的發病機制、監測牙周病的病情變化、確定治療方案。目前已有文獻報道用PCR技術分別檢測牙齦卟啉單胞菌及致病島基因的研究報道，但每個反應只檢測一種rag基因型，不能滿足臨床需要，而建立同時擴增四種rag基因型的多重PCR通過一次反應就可以鑒別出Pg的四種基因型的致病島基因。

發明內容

本發明的目的是針對上述技術問題，提供一種多重PCR技術同時檢測牙齦卟啉單胞菌四種rag基因型，僅通過一次PCR擴增就可鑒別出四種不同rag基因型，提高檢測效率降低檢測成本。

多重PCR技術包括設計擴增Pg的4種rag基因型的特異引物，如下：

牙齦卟啉單胞菌的4種rag基因型特異基因的多重PCR快速檢測方法，包括如下步驟：

1）擴增所用的?DNA模板是用加熱裂解法提取：將標本離心，棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100℃水浴10?min，再離心，取上清作為模板，于-20℃保存；

所述裂解緩沖液為：1.0mmol/L?EDTA,?1.0%?Triton?X-100,10mmol/L?Tris-HCl,pH8.0。

2）將未經稀釋的4對引物的原始液混合后按1對引物稀釋的量進行稀釋，稀釋后的引物作為應用液，計作pm，將4種rag基因型的引物混合稀釋后的引物計作pn；

3）電泳檢測鑒定。

前面所述的多重PCR快速檢測方法，優選的方案在于，步驟1）將標本離心時控制參數為12?000?r/min，2?min，最大離心半徑為6?cm。

前面所述的多重PCR快速檢測方法，優選的方案在于，步驟2）反應體系：

10×TransStart?Taq?Buffer????????2.5ul，

引物混合物（pn）???????????????????2.0ul，

TransStart?Taq?DNA?Polymerase???0.5ul，

dNTPs??????????????????????????????0.5ul，

模板DNA????????????????????????????5.0ul，

無菌雙蒸水?????????????????????????14.5ul，

總體積為???????????????????????????25μl

前面所述的多重PCR快速檢測方法，優選的方案在于，步驟2）PCR反應循環參數為：94℃?5min；94℃?30sec、55℃?30sec、72℃?30sec，33個循環；最后72℃延伸10min，取10μl多重PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異基因。

所述多重PCR擴增口腔中的牙齦卟啉單胞菌不同rag基因型的特異基因，包括如下步驟：

擴增所用的?DNA模板是用加熱裂解法提取，具體步驟如下：

將收集的標本離心（12?000?r/min，2?min，最大離心半徑為6?cm），棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100℃水浴10?min，再離心（12?000?r/min，2min），取上清作為模板，于-20℃保存備用。

以上操作方法和實驗試劑如無特別說明，均為本領域常規操作和市售試劑。

附圖說明

圖1?為通過本發明的檢測技術得到的檢測結果圖；