[發明專利]檢測纖維二糖酶活性的方法

有效

• 申請號: 201210274918.6
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102798617A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 曾光明;賴萃;黃丹蓮;趙美花;張辰;危臻;黃超;許飄;李寧杰;李芳玲
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: G01N21/55
• 分類號: G01N21/55
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術領域

本發明涉及一種檢測生物酶活性的方法，尤其涉及一種檢測纖維二糖酶活性的方法。

背景技術

纖維素酶是一種多組分的復合酶，它包括內切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也稱C_X酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱C₁、微晶纖維酶）和纖維二糖酶（EC3.2.1.21，也稱β-葡萄糖苷酶）等三種主要組分。普遍認為在將天然纖維素降解成葡萄糖的過程中，必須依靠這三種組分的協同作用才能完成。纖維素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進一步將纖維二糖水解成葡萄糖。

目前應用最廣、研究最為深入的纖維素酶生產菌種是里氏木霉（Trichoderma?reesei）的優良突變株。在該菌種的纖維素酶制劑中，內切型及外切型-β-葡聚糖酶活力較高，但不足之處是纖維二糖酶產量很低。在利用纖維素酶制劑水解纖維素的過程中，常常由于纖維二糖酶的活力很低造成纖維二糖的累積，而纖維二糖又會對纖維素酶的催化作用形成強烈的反饋抑制。

在纖維素酶解過程中提高纖維二糖酶的活力意味著提高纖維素水解效率和葡萄糖產量。因此，采用純化的纖維二糖酶、固定化酶技術等多種方法被廣泛用于增強反應體系中纖維二糖酶的活力，而纖維二糖酶的活性成為衡量這些方法優越性的重要指標。

目前，對于纖維二糖酶活性的測定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水楊苷為酶反應底物，檢測水解后產生的極微量的葡萄糖，反應易受干擾，且檢測靈敏度不高；熒光法靈敏度高且快速，但是由于實驗過程操作復雜，且重現性不好，現在應用不多；比色法是以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）為酶底物，檢測底物水解后釋放出來的對硝基苯酚，而對硝基苯酚是一種很難被生物降解的、危害環境的高毒性有機物。因此，研究一種靈敏度及精確度高且對環境無害的纖維二糖酶活性檢測方法是亟待解決的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種更加快速、靈敏、精確、且具有對環境無害、成本低廉的檢測纖維二糖酶活性的方法。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種檢測纖維二糖酶活性的方法，其步驟包括：將一種可用于檢測纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20∶1的體積比加入到待測溶液中，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2～4體積的納米金探針濃縮液（所述濃縮液為納米金探針制備時高速離心后的含納米金探針沉淀的濃縮液），將檢測溫度控制在30℃～35℃，檢測pH值控制在4.0～4.5，待納米金探針反應完全后（一般至少反應10min），根據檢測后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強度變化，即可判斷待測溶液中是否含有纖維二糖酶（定性檢測）（例如，紫外可見分光光度計測定時，當620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值大于0.2631時則可認為含有纖維二糖酶）；所述納米金探針包括納米金顆粒，所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-1-醇。

上述的檢測方法中，所述纖維二糖酶活性與納米金探針表面等離子體共振吸收峰強度呈線性關系，所述線性回歸方程為A=0.3642n+0.6273，其中A優選為紫外可見光吸收圖譜中620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值（A620/A520），根據檢測得到的吸光度比值A即可得到酶活相關值n，再根據表達式C=1.5×10ⁿ即可定量測得待測溶液中的纖維二糖酶酶活C，C的量綱為U/mL（定量檢測）。在定量檢測中，所述纖維二糖酶酶活C的檢測范圍優選為0.15?U/mL～150?U/mL。

上述的檢測方法中，所述納米金探針的粒徑優選為30?nm～80?nm。

上述的檢測方法中，所述納米金探針的Zeta電位優選為-30?mV～-40?mV。