[發(fā)明專利]檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210274918.6
• 申請(qǐng)日: 2012-08-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102798617A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾光明;賴萃;黃丹蓮;趙美花;張辰;危臻;黃超;許飄;李寧杰;李芳玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/55
• 分類號(hào): G01N21/55
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物酶活性的方法，尤其涉及一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。

背景技術(shù)

纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，它包括內(nèi)切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也稱C_X酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱C₁、微晶纖維酶）和纖維二糖酶（EC3.2.1.21，也稱β-葡萄糖苷酶）等三種主要組分。普遍認(rèn)為在將天然纖維素降解成葡萄糖的過(guò)程中，必須依靠這三種組分的協(xié)同作用才能完成。纖維素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進(jìn)一步將纖維二糖水解成葡萄糖。

目前應(yīng)用最廣、研究最為深入的纖維素酶生產(chǎn)菌種是里氏木霉（Trichoderma?reesei）的優(yōu)良突變株。在該菌種的纖維素酶制劑中，內(nèi)切型及外切型-β-葡聚糖酶活力較高，但不足之處是纖維二糖酶產(chǎn)量很低。在利用纖維素酶制劑水解纖維素的過(guò)程中，常常由于纖維二糖酶的活力很低造成纖維二糖的累積，而纖維二糖又會(huì)對(duì)纖維素酶的催化作用形成強(qiáng)烈的反饋抑制。

在纖維素酶解過(guò)程中提高纖維二糖酶的活力意味著提高纖維素水解效率和葡萄糖產(chǎn)量。因此，采用純化的纖維二糖酶、固定化酶技術(shù)等多種方法被廣泛用于增強(qiáng)反應(yīng)體系中纖維二糖酶的活力，而纖維二糖酶的活性成為衡量這些方法優(yōu)越性的重要指標(biāo)。

目前，對(duì)于纖維二糖酶活性的測(cè)定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水楊苷為酶反應(yīng)底物，檢測(cè)水解后產(chǎn)生的極微量的葡萄糖，反應(yīng)易受干擾，且檢測(cè)靈敏度不高；熒光法靈敏度高且快速，但是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性不好，現(xiàn)在應(yīng)用不多；比色法是以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）為酶底物，檢測(cè)底物水解后釋放出來(lái)的對(duì)硝基苯酚，而對(duì)硝基苯酚是一種很難被生物降解的、危害環(huán)境的高毒性有機(jī)物。因此，研究一種靈敏度及精確度高且對(duì)環(huán)境無(wú)害的纖維二糖酶活性檢測(cè)方法是亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更加快速、靈敏、精確、且具有對(duì)環(huán)境無(wú)害、成本低廉的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法，其步驟包括：將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20∶1的體積比加入到待測(cè)溶液中，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2～4體積的納米金探針濃縮液（所述濃縮液為納米金探針制備時(shí)高速離心后的含納米金探針沉淀的濃縮液），將檢測(cè)溫度控制在30℃～35℃，檢測(cè)pH值控制在4.0～4.5，待納米金探針?lè)磻?yīng)完全后（一般至少反應(yīng)10min），根據(jù)檢測(cè)后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，即可判斷待測(cè)溶液中是否含有纖維二糖酶（定性檢測(cè)）（例如，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定時(shí)，當(dāng)620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值大于0.2631時(shí)則可認(rèn)為含有纖維二糖酶）；所述納米金探針包括納米金顆粒，所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-1-醇。

上述的檢測(cè)方法中，所述纖維二糖酶活性與納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系，所述線性回歸方程為A=0.3642n+0.6273，其中A優(yōu)選為紫外可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜中620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值（A620/A520），根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度比值A(chǔ)即可得到酶活相關(guān)值n，再根據(jù)表達(dá)式C=1.5×10ⁿ即可定量測(cè)得待測(cè)溶液中的纖維二糖酶酶活C，C的量綱為U/mL（定量檢測(cè)）。在定量檢測(cè)中，所述纖維二糖酶酶活C的檢測(cè)范圍優(yōu)選為0.15?U/mL～150?U/mL。

上述的檢測(cè)方法中，所述納米金探針的粒徑優(yōu)選為30?nm～80?nm。

上述的檢測(cè)方法中，所述納米金探針的Zeta電位優(yōu)選為-30?mV～-40?mV。