[發(fā)明專利]檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210274918.6 | 申請(qǐng)日: | 2012-08-03 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN102798617A | 公開(kāi)(公告)日: | 2012-11-28 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 曾光明;賴萃;黃丹蓮;趙美花;張辰;危臻;黃超;許飄;李寧杰;李芳玲 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 湖南大學(xué) |
| 主分類號(hào): | G01N21/55 | 分類號(hào): | G01N21/55 |
| 代理公司: | 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008 | 代理人: | 趙洪;楊斌 |
| 地址: | 410082 湖南省長(zhǎng)沙*** | 國(guó)省代碼: | 湖南;43 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 檢測(cè) 纖維 二糖酶 活性 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物酶活性的方法,尤其涉及一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。
背景技術(shù)
纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶,它包括內(nèi)切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4,也稱CX酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91,也稱C1、微晶纖維酶)和纖維二糖酶(EC3.2.1.21,也稱β-葡萄糖苷酶)等三種主要組分。普遍認(rèn)為在將天然纖維素降解成葡萄糖的過(guò)程中,必須依靠這三種組分的協(xié)同作用才能完成。纖維素大分子首先在C1酶和CX酶的作用下逐步降解成纖維二糖,而纖維二糖酶則進(jìn)一步將纖維二糖水解成葡萄糖。
目前應(yīng)用最廣、研究最為深入的纖維素酶生產(chǎn)菌種是里氏木霉(Trichoderma?reesei)的優(yōu)良突變株。在該菌種的纖維素酶制劑中,內(nèi)切型及外切型-β-葡聚糖酶活力較高,但不足之處是纖維二糖酶產(chǎn)量很低。在利用纖維素酶制劑水解纖維素的過(guò)程中,常常由于纖維二糖酶的活力很低造成纖維二糖的累積,而纖維二糖又會(huì)對(duì)纖維素酶的催化作用形成強(qiáng)烈的反饋抑制。
在纖維素酶解過(guò)程中提高纖維二糖酶的活力意味著提高纖維素水解效率和葡萄糖產(chǎn)量。因此,采用純化的纖維二糖酶、固定化酶技術(shù)等多種方法被廣泛用于增強(qiáng)反應(yīng)體系中纖維二糖酶的活力,而纖維二糖酶的活性成為衡量這些方法優(yōu)越性的重要指標(biāo)。
目前,對(duì)于纖維二糖酶活性的測(cè)定普遍采用的方法中,Barush和Swiain法是以水楊苷為酶反應(yīng)底物,檢測(cè)水解后產(chǎn)生的極微量的葡萄糖,反應(yīng)易受干擾,且檢測(cè)靈敏度不高;熒光法靈敏度高且快速,但是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作復(fù)雜,且重現(xiàn)性不好,現(xiàn)在應(yīng)用不多;比色法是以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為酶底物,檢測(cè)底物水解后釋放出來(lái)的對(duì)硝基苯酚,而對(duì)硝基苯酚是一種很難被生物降解的、危害環(huán)境的高毒性有機(jī)物。因此,研究一種靈敏度及精確度高且對(duì)環(huán)境無(wú)害的纖維二糖酶活性檢測(cè)方法是亟待解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種更加快速、靈敏、精確、且具有對(duì)環(huán)境無(wú)害、成本低廉的檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種檢測(cè)纖維二糖酶活性的方法,其步驟包括:將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶活性的納米金探針溶液按照20∶1的體積比加入到待測(cè)溶液中,其中每20體積的納米金探針溶液中含有2~4體積的納米金探針濃縮液(所述濃縮液為納米金探針制備時(shí)高速離心后的含納米金探針沉淀的濃縮液),將檢測(cè)溫度控制在30℃~35℃,檢測(cè)pH值控制在4.0~4.5,待納米金探針?lè)磻?yīng)完全后(一般至少反應(yīng)10min),根據(jù)檢測(cè)后溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化,即可判斷待測(cè)溶液中是否含有纖維二糖酶(定性檢測(cè))(例如,紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定時(shí),當(dāng)620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值大于0.2631時(shí)則可認(rèn)為含有纖維二糖酶);所述納米金探針包括納米金顆粒,所述納米金顆粒上修飾有纖維二糖和6-巰基己-1-醇。
上述的檢測(cè)方法中,所述纖維二糖酶活性與納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系,所述線性回歸方程為A=0.3642n+0.6273,其中A優(yōu)選為紫外可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜中620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值(A620/A520),根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度比值A(chǔ)即可得到酶活相關(guān)值n,再根據(jù)表達(dá)式C=1.5×10n即可定量測(cè)得待測(cè)溶液中的纖維二糖酶酶活C,C的量綱為U/mL(定量檢測(cè))。在定量檢測(cè)中,所述纖維二糖酶酶活C的檢測(cè)范圍優(yōu)選為0.15?U/mL~150?U/mL。
上述的檢測(cè)方法中,所述納米金探針的粒徑優(yōu)選為30?nm~80?nm。
上述的檢測(cè)方法中,所述納米金探針的Zeta電位優(yōu)選為-30?mV~-40?mV。
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- 專利分類
G01N 借助于測(cè)定材料的化學(xué)或物理性質(zhì)來(lái)測(cè)試或分析材料
G01N21-00 利用光學(xué)手段,即利用紅外光、可見(jiàn)光或紫外光來(lái)測(cè)試或分析材料
G01N21-01 .便于進(jìn)行光學(xué)測(cè)試的裝置或儀器
G01N21-17 .入射光根據(jù)所測(cè)試的材料性質(zhì)而改變的系統(tǒng)
G01N21-62 .所測(cè)試的材料在其中被激發(fā),因之引起材料發(fā)光或入射光的波長(zhǎng)發(fā)生變化的系統(tǒng)
G01N21-75 .材料在其中經(jīng)受化學(xué)反應(yīng)的系統(tǒng),測(cè)試反應(yīng)的進(jìn)行或結(jié)果
G01N21-84 .專用于特殊應(yīng)用的系統(tǒng)
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