[發明專利]抗腫瘤蛋白P53單克隆抗體及其用途

有效

• 申請號: 201210274649.3
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102827278A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 何為無;馬東輝;袁克湖;陳堅;王超;陳思;袁麗;龔世妍;周春
• 申請（專利權）人: 無錫傲銳東源生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/574;C12R1/91
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊

技術領域

本發明涉及抗腫瘤蛋白P53的單克隆抗體及其在檢測P53蛋白中的應用。

背景技術

P53基因是一種抑癌基因，是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因，分為野生型和突變型兩種，其蛋白產物為定位于人類染色體17p13.1，由393個氨基酸組成的核內磷酸化蛋白，其分子量為53kD，因此被稱為p53蛋白（Tumor?protein?p53）。P53蛋白分為野生型和突變型，野生型p53蛋白極不穩定，半衰期僅數分鐘，并具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用；突變型p53蛋白穩定性增加，半衰期延長，可被免疫組化方法檢測出來。

p53基因的突變、缺失是人類腫瘤的常見事件，與腫瘤的發生、發展關系密切。目前研究認為引起腫瘤形成或細胞轉化的p53蛋白是p53基因突變的產物，是一種腫瘤促進因子，它可以消除正常p53的功能；而野生型p53基因是一種抑癌基因，它的失活對腫瘤形成起重要作用。一般認為，突變型p53的過表達與腫瘤的轉移、復發及不良預后相關。

p53蛋白臨床意義包括：(1)肝癌患者有一定比例的p53蛋白過表達，p53基因突變可能與肝癌的惡性分化程度有關；(2)p53突變還可見于胃癌、肝癌、大腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系統腫瘤、膠質細胞瘤、軟組織肉瘤等惡性腫瘤。

因此目前臨床上在進行腫瘤治療之前，通常通過免疫組織化學（IHC）病理實驗確定腫瘤細胞中突變型p53的表達水平，起到輔助診斷的目的。IHC實驗的核心為特異性結合p53的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的抗P53蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題為提供一種結合特異性較高的抗P53蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測p53蛋白的免疫檢測工具中的應用。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC），保藏日期為2012年5月16日，保藏編號為CGMCC?No.6136。

本發明還提供了一種特異性結合P53蛋白的單克隆抗體2C4，由上述雜交瘤細胞株產生。

本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：

（1）重組表達載體的構建：根據p53基因的ORF全序列（如SEQID?No.1所示）設計引物進行PCR擴增，基因兩側分別引入限制性內切酶位點SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK標簽序列（如SEQ?ID?No.2所示），插入表達載體pCMV6-Entry，構建p53重組表達質粒；

（2）P53重組蛋白的表達與純化：以該質粒轉染HEK293T細胞，裂解離心取上清，DDK親和層析柱純化，獲得純化的P53重組蛋白；

（3）單抗的篩選與制備：采用上述P53重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗P53特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為2C4，亞型鑒定為IgG1；制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化P53單抗2C4。分別通過Western?Blot、免疫組化實驗、免疫熒光驗證該單抗的靈敏度和特異性。

上述單克隆抗體的特異性驗證：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10400個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。

將本發明單克隆抗體2C4與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯示：本發明單克隆抗體2C4特異性結合P53蛋白，與其他蛋白無交叉反應。

本發明還提供了單克隆抗體2C4在制備用于檢測P53蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體2C4；可檢測組織細胞中突變型p53的表達狀況。

本發明還提供了上述單克隆抗體在制備用于診斷p53相關性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應用。由于突變型p53的表達增高與腫瘤的發生、發展關系密切，因此使用本發明單克隆抗體檢測突變型p53的水平高低，可用于輔助診斷p53相關性腫瘤。