[發明專利]一種化學發光檢測試劑盒及制備方法有效

申請號：	201210274507.7	申請日：	2012-08-03
公開（公告）號：	CN102798723A	公開（公告）日：	2012-11-28
發明（設計）人：	鄒檢平	申請（專利權）人：	北京華創遠航科技有限公司
主分類號：	G01N33/68	分類號：	G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
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搜索關鍵詞：	一種化學發光檢測試劑盒制備方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人血管內皮細胞生長因子（VEGF）的化學發光檢測試劑盒。

背景技術

腫瘤的發展和轉移是多階段的、復雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細胞與宿主之間錯綜復雜的關系，其機理尚不甚清楚。近年來關于新的血管生成與腫瘤發展、轉移和預后關系的研究進展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉移和轉移灶生長的必要條件，血管內皮細胞生長因子（VEGF）是調節新血管生成的最重要的細胞因子。研究表明血管內皮細胞生長因子（VEGF）在血管系統的發育分化中具有不可替代的作用（Ferrara?et?al.?Endocr.?Rev.1997,18:4-25）。

VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結合形成，等電點為8.5，有很強的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構體，分別為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。

VEGF高親和力結合位點僅位于血管內皮細胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內皮細胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力（Kendall?et?al.?PNAS?USA,?1993,?90:?10705-9）。

VEGF是癌癥生長、轉移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤（即癌癥）疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻報道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當腫瘤因化療或手術“臨床治愈”時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預后的指標。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

化學發光免疫測定(chemiluminesent?immunoassay，CLEIA)是免疫測定技術繼酶免技術、放免技術、熒光免疫技術和時間分辨熒光免疫技術之后發展的一項新興測定技術。其基本原理是將化學發光系統與免疫反應相結合，以檢測樣本中的抗原或抗體，由于它既具有免疫反應的高度特異性，又具有發光反應的高敏感性，近年來已被國內外臨床實驗室及科研單位，廣泛應用于各種激素、特種蛋白及藥物的監測和分析。該方法具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快捷、標記物穩定、無污染、儀器簡單經濟等有點。

目前，用過氧化氫和辣根過氧化物酶（HRP）聯合催化魯米諾類化合物發光的化學發光免疫測定效果比較好，應用比較廣泛。

發明內容

本發明的目的是提供一種化學發光免疫檢測人血管內皮細胞生長因子（VEGF）的檢測試劑盒。該試劑盒結果準確穩定、特異性強、靈敏度高、使用方便、便于推廣。

本發明的另一目的是提供上述發光檢測試劑盒的生產制備及使用方法。

為實現上述目的，本發明提供的試劑盒組成為：

1.?反應板；2.?酶結合物；3.?標準品；4.?樣品稀釋液；5.?濃縮洗滌液；6.?發光底物A、B；7.?封板膠紙。

本發明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下：

（a）以發光反應板為固體支持物，將VEGF單克隆抗體包被于固體支持物上；

（b）用封閉液封閉；

（c）將生物標本與固定于發光板上的VEGF單克隆抗體接觸和保溫，生物標本中的VEGF特異地與VEGF單克隆抗體結合；

（d）從VEGF單克隆抗體上分離生物標本；

（e）用辣根過氧化物酶（HRP）標記的VEGF多克隆抗體檢測VEGF，所用的發光底物為魯米諾溶液。