[發明專利]基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201210274210.0
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN102827948A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 周小明;詹芳芳;邢達
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

1.一種基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）模板的準備：提取食源性病毒的DNA或RNA；對于RNA，需逆轉錄得到cDNA；

（2）設計合成用于擴增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠連接引物：5’-3’方向依次為用于與磁珠反應的功能基團、用于隔開磁珠和核心序列的聯結鏈和核心序列，核心序列根據模板序列設計得到；②助引物：為磁珠連接引物中的核心序列；③熒光標記引物：根據模板序列設計得到、且能與助引物進行PCR擴增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端標記有熒光染料；

（3）制備磁性引物：將步驟（2）中的磁珠連接引物與功能化磁珠反應得到磁性引物；

（4）PCR反應：將步驟（1）制備的模板，步驟（2）設計合成的熒光標記引物、助引物和步驟（3）制備的磁性引物進行PCR擴增反應，得到PCR產物；

（5）分離純化：將步驟（4）所得的PCR產物進行分離純化，得到帶有熒光染料的PCR產物的磁珠；

（6）檢測：對步驟（5）所得的帶有熒光染料的PCR產物的磁珠用流式細胞儀檢測熒光信號，熒光信號值高于閾值即表明樣品中含有食源性病毒，根據引物的種類即可判斷樣品中食源性病毒的種類。

2.根據權利要求1所述的基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于：

步驟（2）中所述的食源性病毒保守序列為食源性病毒特異基因的保守序列；

步驟（2）中所述的用于與磁珠反應的功能基團為氨基、羧基、磷酸基、生物素、鏈霉親和素、羥基或巰基；

步驟（2）中所述的聯結鏈為不影響PCR反應特異性的隨機DNA序列；

步驟（2）中所述的熒光染料為FAM、FITC、Cy5或Alexa?Fluor?488。

3.根據權利要求1所述的基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于：

步驟（3）中所述的功能化磁珠的粒徑為20nm～10μm；

步驟（3）中所述的功能化磁珠為表面修飾有功能基團的磁珠，所述的功能基團為氨基、羧基或巰基；

步驟（3）中所述的磁性引物的制備方法為：將磁珠連接引物與處理后的功能化磁珠在連接反應液中孵育，純化，得到磁性引物；其中，磁珠連接引物與磁珠按2～20nmol/mg配比；所述的處理的方式為先用0.01M氫氧化鈉溶液清洗功能化磁珠，再用去離子水沖洗；所述的連接反應液為：0.1M的2-嗎啉乙磺酸，體積百分比0.25%的吐溫-20，10mM的碳二亞胺鹽酸鹽，pH值為5.0；所述的孵育的條件為室溫條件反應3～5小時；所述的純化為通過磁分離器分離磁性引物，并用純化緩沖液清洗，所述的純化緩沖液為：10mM、pH?7.4的PBS中加入吐溫-20，吐溫-20的終濃度為體積百分比0.25%。

4.根據權利要求1所述的基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的PCR反應的體系包含：模板、Taq酶、Taq酶緩沖液、dNTP、磁性引物、助引物、熒光標記引物、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白；所述的磁性引物的終濃度為0.1～0.3μg/μL；所述的助引物的終濃度為20～60nM，所述的熒光標記引物的終濃度為300～500nM，助引物與熒光標記引物按摩爾比1:5～1:25配比；所述的TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白的終濃度分別為體積百分比0.1%、體積百分比0.5%和質量百分比0.05%。

5.根據權利要求1所述的基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于：步驟（5）中所述的分離純化為通過磁分離器進行分離，并用純化緩沖液清洗；所述的純化緩沖液為：10mM、pH?7.4的PBS中加入吐溫-20，吐溫-20的終濃度為體積百分比0.25%。

6.根據權利要求1所述的基于磁性引物擴增的流式細胞術檢測食源性病毒的方法，其特征在于：步驟（6）中所述的檢測的方法為：將步驟（5）得到的磁珠用檢測緩沖液沖洗，然后用檢測緩沖液重懸磁珠，再轉入流式細胞儀進行檢測；所述的檢測緩沖液為：1倍Taq酶緩沖液中加入吐溫-20，吐溫-20的終濃度為體積百分比0.25%。