[發明專利]一株耐熱α-淀粉酶及其基因工程菌的構建方法

有效

• 申請號: 201210274173.3
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102851266A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 吳敬;陳晟;李祝;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一株α-淀粉酶基因工程菌及其構建方法，屬于酶工程和基因工程領域。?

背景技術

淀粉酶是能夠降解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱。按照水解方式的不同，主要分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶和普魯蘭酶。?

淀粉作為原料在工業中的應用，其最主要的方式是將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖或者寡糖糖漿。這些糖漿隨后被用作原料用于如酒精、有機酸、氨基酸等工業生產或直接作為產品用于其他工業領域。目前工業上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工藝一般采用兩步法，第一步用α-淀粉酶將淀粉水解成低分子量的糊精，第二步用糖化酶將糊精水解成葡萄糖。α-淀粉酶的作用特點是在淀粉分子鏈中間將α-1,4糖苷鍵切斷。?

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供了一種耐熱α-淀粉酶，其氨基酸序列如1)、或2）或3）所示：?

1)其氨基酸序列如SEQ?NO.1所示；?

2).在1)所限定的氨基酸序列的基礎上經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺少或添加，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列；?

3).與1)、或2）所限定的氨基酸序列具有90%同源性的，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列。?

所述的α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ?NO.2所示。?

本發明所解決的另一個技術問題是提供了一株表達α-淀粉酶的基因工程菌。本發明所解決的另一個技術問題是提供了一種α-淀粉酶基因工程菌的構建方法包括如下步驟：?

1)化學合成α-淀粉酶基因；?

2).將α-淀粉酶基因克隆到重組表達載體；?

3).將重組表達載體轉化到宿主細胞中。?

所述的重組表達質粒載體為為pUC系列，pET系列pT7-7，或pGEX中的任意一種，其中優選重組表達質粒載體為pET-20b。?

所述的宿主細胞包括：細菌，酵母及真菌，也是本發明所要保護的范圍。?

所述的細菌主要是大腸桿菌包括：E.coli?BL21(DE3)、E.coli?W3110、E.coli?JM109、E.coliJM109(DE3)、E.coli?DH5α中任意一種。?

本發明所解決的另一個技術問題是提供一種α-淀粉酶的基因工程菌的發酵生產方法，37℃，220rpm，搖瓶發酵48小時后，重組α-淀粉酶搖瓶發酵活力達到742U/mL。?

利用本發明獲得的α-淀粉酶具有良好的穩定性，在95℃下保溫4h后還有70%的酶活，編碼基因構建重組微生物，可實現α-淀粉酶的高效率生產，搖瓶發酵48小時后，重組α-淀粉酶搖瓶發酵活力達到742U/mL，具有很好的工業應用前景。?

附圖說明

圖1重組α-淀粉酶搖瓶發酵產酶曲線。?

圖2重組α-淀粉酶蛋白SDS-PAGE圖。?

1、發酵液上清；2、破壁上清；3、包涵體；M、標準蛋白分子量。?

圖3重組α-淀粉酶分批補料發酵產酶曲線。?

圖4重組α-淀粉酶溫度穩定性曲線。?

具體實施方式

實施例1：基因工程菌的構建?

1、將合成的α-淀粉酶基因片段克隆到pUC57載體上。?

2、用于構建大腸桿菌的質粒是pET-20b，帶有T7啟動子。將pET-20b質粒和帶有目的基因片段的pUC57分別進行NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞，經37℃培養8h，挑轉化子在含有30μg/mL卡那霉素的LB中振蕩培養，提取質粒，酶切驗證得到的重組表達質粒。?

3、將重組表達質粒轉化E.coli?BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素（30μg/mL）的LB平板上，37℃培養8h。挑單菌落至液體LB中，37℃培養過夜，獲得基因工程菌。?

實施例2：含α-淀粉酶基因工程菌的搖瓶發酵?