[發(fā)明專利]固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210273872.6
• 申請(qǐng)日: 2012-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN102775471A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐紅巖;沈永剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉爾生化（上海）有限公司;上海吉爾多肽有限公司;濱海吉爾多肽有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責(zé)任公司 31113
• 代理人: 張勁風(fēng)

1.固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是具體包含以下步驟：?

??1）.液相法合成L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺：將N-(叔丁氧羰基)-L-苯基丙氨酸用有機(jī)溶劑溶解，然后C端酰胺化得到N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙酰胺,再和芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂加激活試劑反應(yīng)，反應(yīng)得到?N-(9芴甲氧羰基)?L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺,然后用哌啶脫芴甲氧羰基保護(hù),萃取，旋蒸，結(jié)晶得到L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺；

?2）.固相法合成八肽膽囊收縮素全保護(hù)片段：將N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸用有機(jī)溶劑溶解加到二氯三苯基樹脂中，再加有機(jī)堿，室溫反應(yīng)2-3小時(shí)，完畢后，用甲醇封閉，用布氏漏斗過(guò)濾氨基酸樹脂，再用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇依次洗滌收縮，把做完的樹脂放到固相反應(yīng)器中，溶脹，然后加脫保護(hù)液脫保護(hù)，然后洗滌，加入片段的第二個(gè)具有芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的氨基酸和激活試劑反應(yīng)，控溫反應(yīng)1-2個(gè)小時(shí),?凱撒試驗(yàn)檢測(cè)，反應(yīng)完全后，脫芴甲氧羰基保護(hù)，依次往下偶聯(lián)，最后得到八肽膽囊收縮素全保護(hù)片段肽樹脂；

3）.弱酸切割全保護(hù)片段：往八肽膽囊收縮素全保護(hù)片段肽樹脂中加入適量的弱酸切割液，室溫切割，得到八肽膽囊收縮素全保護(hù)片段；

?4)?.液相縮合全保護(hù)片段和二肽片段得到全保護(hù)八肽膽囊收縮素：八肽膽囊收縮素全保護(hù)片段與之前的L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺，再加1-羥基-苯并-三氮唑以及N-甲基嗎啡啉和N,N-二異丙基乙胺中的一種，冰浴下攪拌，加入縮合劑，反應(yīng)后撤掉冰浴，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后得到全保護(hù)八肽膽囊收縮素；

?5）.切割：將全保護(hù)八肽膽囊收縮素加入切割液切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽膽囊收縮素粗品；

?6）．粗品通過(guò)高相液相色譜純化，制備，旋蒸，凍干得到八肽膽囊收縮素精品：采用C18類型的反相分離設(shè)備純化八肽膽囊收縮素粗品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟1）所述的有機(jī)溶劑為四氫呋喃，激活試劑為N，N-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基-苯并-三氮唑的混合試劑，所述的C端酰胺化是以N-甲基嗎啡啉作為有機(jī)堿，然后滴加氯甲酸乙脂作為羧基活化試劑，加氨水反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟2）所述二氯三苯基樹脂替代度在：0.9-1.2mmol/g,所用的有機(jī)溶劑為二氯甲烷，所用的有機(jī)堿為N,N-二異丙基乙胺，投料比為：N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸:?二氯三苯基樹脂:?N,N-二異丙基乙胺的體積比：0.6:1:2.5；所述的脫保護(hù)液為質(zhì)量百分含量為20%的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟2）脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為5min+15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟2）所述具有芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，分別為：N-(9芴甲氧羰基)-色氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-甘氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-磺酸鈉鹽酪氨酸、芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂,激活試劑選擇：N，N-二異丙基碳化二亞胺/1-羥基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸/1-羥基-苯并-三氮唑或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羥基-苯并-三氮唑混合試劑中的一種，偶聯(lián)反應(yīng)中的有機(jī)堿為：N,N-二異丙基乙胺或N-甲基嗎啡啉。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟2）一次偶聯(lián)反應(yīng)完畢和脫芴甲氧羰基保護(hù)后，都需要用凱撒試驗(yàn)檢測(cè)，凱撒試驗(yàn)為三種溶劑：A:?質(zhì)量百分含量為5%的茚三酮乙醇溶液、B：質(zhì)量百分含量為80%的苯酚乙醇溶液、C：重蒸吡啶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟3）所述弱酸溶液為：質(zhì)量百分含量為1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液或者醋酸:三氟乙醇:二氯甲烷體積比=2:2:6的混合液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合合成八肽膽囊收縮素的方法，其特征是步驟4）所述縮合試劑為二環(huán)己基碳二亞胺。