[發明專利]制備細菌核酸指紋特征譜庫的方法

無效

• 申請號: 201210273369.0
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN103060925A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 馬慶偉;趙洪斌;張海燕;趙艷梅
• 申請（專利權）人: 向華
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/10
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種細菌核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對細菌進行分類與鑒定的方法。

背景技術

早期的細菌學分類主要是采用以形態培養特征和生理生化特征為依據的傳統細菌學分類方法。但是由于細菌的這種表面特征往往受很多人為因素的影響與限制，特別是人們主觀判斷的差異反而難以反映出細菌的自然親緣關系，這就體現了只建立在形態特征和生理生化特征基礎上的傳統分類學的局限性。

因此，Colweel提出了一個新的細菌分類學術語“多相分類（Polyphasic?taxonomy）”，它是指綜合利用微生物多種不同信息，包括表型和基因型的信息進行分類的方法。分子分類和系統發育信息豐富了多相分類的內容，共同推動細菌分類向著自然分類系統靠近。應用于分類的分子指標主要為DNA和RNA，而DNA同源性分析是確定正確的分類地位，建立自然分類系統的最直接的方法。此類方法簡便易行，分辨率高，在細菌系統分類學研究中起著越來越重要的作用。

使用質譜技術進行細菌分類和鑒定的原理在于，組成遺傳物質DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質量差異，對細菌基因組DNA上某個或某幾個片段進行PCR和酶切后，將產生分子量和豐度各異的片段，使用質譜檢測可產生核酸指紋圖譜，不同細菌之間基因組DNA存在差異，將產生不同的核酸指紋圖譜，建立數據庫后，可以實驗結果與數據庫進行比對，即可完成對細菌的鑒定。

已有一些公開文獻使用質譜技術對微生物進行分類和鑒定，例如，中國專利申請CN102337223A、“產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法”，公開了一種檢測產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鑒定方法，其中從平板上挑取產黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養基培養，預處理得到粗蛋白溶液在色譜柱上分離純化，并在羧甲基陽離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進行MALDI-TOF鑒定。該方法僅適用于特定微生物，且需要多重蛋白純化過程，最終用MALDI-TOF鑒定特征蛋白Pc-Arctin，其過程繁瑣、適用面窄，不能實現質譜分類細菌或微生物的目的。

中國專利申請200910157210、“一種李斯特菌屬細胞中脂肪酸組分的分析方法”公開了一種利用氣相色譜質譜(GC-MS)分析法針對細菌脂肪酸進行分類的方法，包括：李斯特菌復壯，用牛津瓊脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂平板分別分離和純化李斯特菌，培養單個典型菌落的李斯特菌并制成菌懸液，用甲醛滅活處理，把經甲醛處理后的菌懸液平均分裝在離心管洗滌，用鹽酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸進行氣相色譜質譜(GC-MS)分析。雖然該方法打破傳統細菌分類學的局限，減少人為因素對傳統形態分類帶來的誤差，同時為新的菌種和毒種的分類鑒定提供強有力的工具，但該法仍然屬于利用質譜法進行細胞化學分析分類，并未針對核酸進行檢測。

國際專利申請WO2010/021548、“Method?for?identifying?biological?material?e.g.?bacteria?in?sample?of?patient,?involves?separating?stream?of?liquid?containing?sample?into?successive?portions?to?form?flying?drops?and?ionizing?flying?drops?to?measure?mass?spectra”，公開了一種使用MALDI-MS(基質輔助激光解吸和電離質譜)用于識別生物材料的方法和裝置，包括準備包含試樣和MALDI基質材料的液體，并將其用于形成液體的連續流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發射到飛行中的液滴，或將流束發射到飛行中，然后分散成液滴。可使用從噴墨印刷機中已知的液滴形成技術。對飛行中的液滴電離出材料。測量來自各個液滴的電離材料的質譜。但該方法目的在于如何改善MALDI-MS檢測生物物質的靈敏度，并不涉及質譜鑒定和分類任意微生物，因此也不能解決上述技術問題。