[發明專利]一種重組人表皮生長因子工程菌的構建和篩選方法

無效

• 申請號: 201210272216.4
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN102978231A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 鄭春陽;王磊;王巍;徐彬
• 申請（專利權）人: 天津強微特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組人表皮生長因子(hEGF)工程菌的構建和篩選方法，其特征在于重組hEGF工程菌的構建和篩選方法按以下步驟進行：一、通過PCR技術獲得卡那霉素抗性基因，通過化學合成方式獲得大腸桿菌cspA基因功能元件；二、對編碼SUMO蛋白的基因和編碼hEGF的基因序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，進行密碼子優化，然后進行化學合成獲得適合在大腸桿菌中大量表達的序列OPT-SUMO-hEGF；三、將第一步和第二步所得的片段連入pET21質粒中，得到pET-Kan-cspA-SE質粒；四、以pET-Kan-cspA-SE質粒為模板，構建轉座體；五、將轉座體轉入大腸桿菌Origami?2(DE3)；六、篩選出融合蛋白SUMO-hEGF表達量高的菌株。

2.根據權利要求1所述的重組hEGF工程菌的構建和篩選方法，其特征在于在適合的PCR反應條件下，獲得卡那霉素抗性基因。

3.根據權利要求2所述的利用PCR方法獲得卡那霉素抗性基因所用的初始質粒為pET42a。

4.根據權利要求2所述的利用PCR方法獲得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下：

引物Kan-1：5′-ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQID?NO：1)

引物Kan-2：5′-aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3′(SEQID?NO：2)。

5.根據權利要求1所述的重組hEGF工程菌的構建和篩選方法，?其特征在于cspA基因功能元件的序列為：

ggcaaattca?tatgaaggaa?tggtgtggcc?gattaatcat?aaatatgaaa

aataattgtt?gcatcacccg?ccaatgcgtg?gcttaatgca?catcaaattg

tgagcggata?acaatttgat?gtgctagcgc?atatccagtg?tagtaaggca

agtcccttca?agagttatcg?ttgatacccc?tcgtagtgca?cattccttta

acgcttcaaa?atctgtaaag?cacgccatat?cgccgaaagg?cacacttaat

tattaagagg?taatacacca?tgaatcacaa?agtgggatcc?aagctttagg

taatctctgc?ttaaaagcac?agaatctaag?atccctgcca?tttggcgggg

atttttttat?ttgttttcag?gaaataaata?atcgatcgcg?taataaaatc

tattattatt?tttgtgaaga?ataaatttgg?gtgcaatgag?aatgcgcagg

ccctttcgtc?tcgcgcctcg?aggcagtct。

6.根據權利要求1所述的重組hEGF工程菌的構建和篩選方法，其特征在于選用pET21為初始質粒來構建pET-Kan-cspA-SE質粒。

7.根據權利要求6所述的選用pET21為初始質粒構建pET-Kan-cspA-SE質粒，該結構構建需要以下步驟：通過雙酶切和連接，把卡那霉素抗性基因片段插入pET21質粒構建pET-Kan質粒；通過雙酶切和連接，把cspA基因片段插入pET-Kan質粒構建pET-Kan-cspA質粒；通過兩步酶切和連接，把OPT-SUMO-hEGF序列插入pET-Kan-cspA質粒構建pET-Kan-cspA-SE質粒。