[發(fā)明專利]一種可維持細胞活性的組織凍存液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210272114.2
• 申請日: 2012-08-01
• 公開（公告）號: CN102907416A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設計）人: 曹衛(wèi);張麗;張露億;趙光宇;李玉娟
• 申請（專利權）人: 臻景生物技術（上海）有限公司;臻景生物技術（無錫）有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;趙向輝

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種可維持細胞活性的組織凍存液。

背景技術

低溫冷凍保存是活體組織長期保存的一種有效方法，主要通過降低細胞的代謝率來起到保護作用，凍傷是低溫保護最大的負反應，其原因可能為冰晶所致的機械性損傷和滲透性損傷。目前組織的凍存主要有兩種方法：快速凍存法，即玻璃化法；慢速凍存法，即程序降溫法。慢速凍存法較為常用。但是如果沒有采取合適的凍存方法和合適的冷凍保護劑，組織在凍存過程中容易被凍傷

超低溫冷凍保存是在液氮(-196℃)中使保存的活細胞物質(zhì)代謝和生長幾乎完全停止的保存方法。在這樣冷凍的條件下，調(diào)節(jié)和控制細胞生長代謝的各類酶的作用受到極大抑制，使細胞內(nèi)部的生化反應十分緩慢，甚至停止，從而避免細胞遺傳性狀的改變，細胞和組織不會喪失形態(tài)發(fā)生的潛能。但是，單純的超低溫保存會對細胞造成兩方面的損傷。其一，在低溫保存的過程中，細胞外部的水分首先結冰，使得未結冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，造成細胞死亡，這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷；其二，隨著溫度的降低,細胞內(nèi)的水分也會結冰，所形成的冰晶進一步破壞細胞膜和細胞器，這種因細胞內(nèi)部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。影響損傷程度的因素主要有冷凍速度、融凍速度及冷凍保護劑。

冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，一般可分為滲透性與非滲透性兩類。一般非滲透性保護劑是大分子聚合物，不能滲透到細胞內(nèi)部，通過稀釋胞外電解質(zhì)的濃度，減少溶質(zhì)損傷和結合水分子，降低胞外自由水的含量，減少冰晶損傷。常用的有：蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及羥乙基淀粉(hydroxyephylstarch，HES)等。而滲透性保護劑則主要為小分子物質(zhì)，多易溶于水，與水分子結合的能力強，易穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，在細胞內(nèi)能降低細胞的冰點；并提高細胞膜對水的通透性，減少冰晶形成；復蘇時促進細胞外水分進入細胞，緩解滲透性腫脹引起的損傷；稀釋未結冰溶液中電解質(zhì)的濃度，減少溶質(zhì)損傷。主要有以下幾種：甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇等。

在前兩種因素冷凍速度和融凍速度受目前工藝條件的限制，無法在短期內(nèi)有較大改進的前提下，冷凍保護劑的正確選擇及應用就成為了決定凍存效果的最關鍵因素。

脂肪干細胞（adipose-derived?stem?cells，ADSCs）是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發(fā)現(xiàn)ADSCs細胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規(guī)模培養(yǎng)，對機體損傷小等優(yōu)點，而且其來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。采用合適的方法凍存脂肪組織,并從中取得干細胞,可以為臨床應用提供良好的條件，因此本領域迫切需要開發(fā)新穎有效的且適合脂肪組織的凍存液。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種有效的可用于脂肪組織的凍存液及脂肪組織的凍存方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種凍存液，包含以下組分：海藻糖、二甲基亞砜和血清替代物KSR。

在另一優(yōu)選例中，所述海藻糖的濃度為0.05~2mol/l；所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為1:1~10。

在另一優(yōu)選例中，所述海藻糖的濃度為0.1~0.5mol/l；所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為1:1~5。

本發(fā)明的凍存液可以由海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR混合均勻后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為0.5~20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4：1-4：13-18。

在另一優(yōu)選例中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為0.5~10mol/l，較佳地為05~8mol/l。

在另一優(yōu)選例中，所述二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4：1-4：13-18；較佳地，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-1.5：1-1.5：9-11。

本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的凍存液的用途，被用于長期保存脂肪組織和/或建立脂肪組織庫。

本發(fā)明的第三方面，提供一種脂肪組織混合物，所述混合物包括以下組分：

脂肪組織，和

第一方面所述的凍存液。

在另一優(yōu)選例中，所述脂肪組織與所述凍存液的體積比為1:0.5-5，較佳地，為1:0.8-2。

在另一優(yōu)選例中，所述脂肪組織與所述凍存液的體積比為1:1-1.5。