[發(fā)明專利]高通量篩選高效表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210271826.2
• 申請(qǐng)日: 2012-08-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876706A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董志揚(yáng);秦麗娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/64;G01N15/14;G01N21/64;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N9/20;C12R1/885
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

1.鑒定或輔助鑒定表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟：

1）將紅色熒光蛋白基因通過(guò)連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信號(hào)肽序列；所述連接肽2A序列編碼序列表中序列8的第290-306位所示的連接肽2A；

2）制備融合基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒以及含有所述融合基因表達(dá)盒和所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體；

3）用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化里氏木霉，得到轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子并制備成原生質(zhì)體，收集所述轉(zhuǎn)化子的原生質(zhì)體細(xì)胞；

4）用流式細(xì)胞儀對(duì)步驟3）的所述原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行分選，有紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉或候選表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉，無(wú)紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為非表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉或候選非表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合基因是權(quán)利要求6-8中任一所述的融合基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合基因表達(dá)盒由纖維二糖水解酶I基因的啟動(dòng)子、纖維二糖水解酶I基因終止子和位于二者之間的所述融合基因組成，所述纖維二糖水解酶I基因的啟動(dòng)子位于所述融合基因的上游。

4.權(quán)利要求1-3中任一所述的方法在篩選高表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉中的應(yīng)用。

5.篩選高表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟：比較經(jīng)權(quán)利要求1-3中任一所述方法鑒定的表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉的紅色熒光強(qiáng)度，根據(jù)紅色熒光強(qiáng)度的高低鑒定外源蛋白的表達(dá)能力，紅色熒光強(qiáng)度越高的表達(dá)外源蛋白的重組里氏木霉的外源蛋白表達(dá)能力越高。

6.融合基因，是由紅色熒光蛋白基因通過(guò)連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述連接肽2A序列的核苷酸序列為序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合基因，其特征在于：所述外源蛋白基因?yàn)橹久富颍凰鲋久富蚓幋a的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述紅色熒光蛋白基因編碼的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因的編碼序列為B1-B3中的任一種：

B1、序列表中序列7的第1-1596位；

B2、序列表中序列7的第58位-1596位；

B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位。

9.下述任一種材料：

1）由權(quán)利要求6-8中任一所述的融合基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子；

2）含有權(quán)利要求6-8中任一所述的融合基因的重組載體、重組細(xì)胞或重組微生物；

3）含有1）所述RNA分子的重組載體、重組細(xì)胞或重組微生物；

4）由權(quán)利要求6-8中任一所述的融合基因編碼的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為A1-A4中的任一種：

A1、序列表中的序列8；

A2、序列表中的序列8第20-531位；

A3、序列表中的序列6；

A4、將序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列。

10.里氏木霉(Trichoderma?reesei)，其特征在于：所述里氏木霉(Trichoderma?reesei)的菌株號(hào)為TR1124，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC?No.6384。