[發明專利]與番茄黃化卷葉病毒病抗性基因Ty-2緊密連鎖的分子標記

有效

• 申請號: 201210270653.2
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102766626A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 杜永臣;國艷梅;楊曉慧;王孝宣;高建昌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種與番茄黃化卷葉病毒抗性基因緊密連鎖的分子標記及其應用。

背景技術

番茄黃化卷葉病毒(TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),主要通過煙粉虱(Bemisia?tabaci)傳播。TYLCV起源于中東地區和地中海盆地，主要分布在地中海西部、日本、美國東南部和加勒比海地區，是一種熱帶、亞熱帶地區極具毀滅性的番茄病毒病。自1964年被正式命名以來(Cohen?and?Harpaz?1964)，已經在中東、歐洲、東南亞、東亞及非洲等眾多國家和地區相繼造成危害(Czosnek?and?Laterrot,1997;Polston?and?Anderson1997;Moriones?and?Navas-Castillo,2000)。自20世紀90年代起，在中國的浙江、上海、廣西、云南、江蘇、河南、廣東、福建、海南和臺灣等地也相繼在番茄上發現有TYLCV的危害(蔡健和等，2006；何自福等，2007；王東生等，2007；趙統敏等，2007)。

TYLCV對番茄生產存在著嚴重威脅，而選育抗病品種是防治這一病害最有效的方法。研究表明，野生番茄中存在抗TYLCV的基因，其中抗病基因Ty-2在越南、印度、以色列和我國大陸等地特別是亞洲地區均表現出對TYLCV的較高抗性。Ty-2是一個來自于多毛番茄的單個顯性基因，最初被定位在第11號染色體的長臂約19cM的片段上，2009年被進一步定位在6.5cM區域內(Hanson?et?al.,2006;Ji?et?al.,2007c;Ji?et?al.,2009)。鑒于此,對Ty-2基因進行精細定位，獲得與與Ty-2緊密連鎖甚至共分離的分子標記，將為Ty-2的克隆奠定基礎，同時為Ty-2基因的抗病育種提供更緊密連鎖的分子標記。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記。

本發明的另一目的在于提供該分子標記在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位或檢測以及標記輔助育種中的應用。

為了實現本發明目的，本發明提供了一種與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQID?No.1所示。

本發明還提供了一種擴增與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記的引物對，該引物對序列如下：

P1:5’-CACACATATCCTCTATCCTATTAGCTG-3’；

P2:5’-CGGAGCTGAATTGTATAAACACG-3’。

本發明還提供了一種含有上述分子標記的載體。

本發明還提供了一種與番茄黃化卷葉病毒抗性基因緊密連鎖的分子標記的檢測方法，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經PCR擴增，得到能同時鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶，該特異譜帶包括攜帶抗性基因的植株譜帶和不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因的植株譜帶為核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的分子標記。

所述不攜帶抗性基因的植株譜帶的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

上述方法中，PCR反應體系為：

10μL反應體系包括正、反向引物各0.4μM，0.8mM?dNTPs，2.5mMMgCl₂,1μl?10X?buffer，0.25units?Taq聚合酶(New?England?Biolabs,Ipswich,MA)，DNA模板15ng。

上述方法中，PCR擴增程序為：94℃預變5min;94℃變性30s,55℃或60℃退火45s,72℃延伸30-60s,37個循環;72℃延伸5-10min。

本發明還提供了上述分子標記和檢測方法在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位或檢測或標記輔助育種中的應用。

本發明具備的有益效果在于：

1）本發明的分子標記進一步定位了番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2。標記的特異性強、穩定性高，并且標記的篩選方法操作簡便快捷，對檢測設備和引物模板質量要求不高，具有試驗試劑用量少，速度快，成本低，適合大批次、高通量、自動化的優點。非常適合現代農業分子育種的實現；

2）本發明為番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2的圖位克隆提供了重要的分子遺傳學信息；