[發明專利]一種豬圓環病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應用

有效

• 申請號: 201210270504.6
• 申請日: 2012-08-01
• 公開（公告）號: CN102925486A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 朱薇;熊媛媛;漆世華;張萍;秦紅剛;李偉;廖園園;謝紅玲;溫文生;王楨楨;靖志強;吳玉石;韓興;劉潔
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/34;C12N7/01;C07K14/01;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;范曉斌

1.一種重組桿狀病毒轉移載體，所述載體是分別在pFastBac?Dua1轉移載體的P10啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2?Cap蛋白編碼基因ORF2，優選所述的PCV2?Cap蛋白編碼基因ORF2是完整的、未經修飾的PCV2b?ORF2，更優選所述PCV2?Cap蛋白編碼基因ORF2分別通過BamH?I/Hind?III和Kpn?I/Xho?I雙酶切插入pFastBac?Dual轉移載體中。

2.如權利要求1所述的重組桿狀病毒轉移載體，其特征在于，所述的PCV2?Cap蛋白編碼基因ORF2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.如權利要求1-2任一項所述的重組桿狀病毒轉移載體，其特征在于，所述重組桿狀病毒轉移載體為pFastBac?Dua1-2ORF2。

4.一種豬圓環病毒2型亞單位疫苗生產用毒株的制備方法，包括如下步驟：

（1）獲得如權利要求1-5任一項所述的重組桿狀病毒轉移載體；

（2）同源重組，產生重組桿狀病毒DNA；

（3）包裝，產生表達PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的同源重組是將步驟(1)所述的重組桿狀病毒轉移載體轉化進含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態細胞DH10Bac中，產生重組桿狀病毒DNA。

6.如權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的包裝是將步驟(2)產生的重組桿狀病毒DNA轉染sf9細胞，包裝出重組桿狀病毒。

7.一種重組桿狀病毒，由權利要求4-6任一項所述的方法制備得到，優選所述重組桿狀病毒為rBac-2ORF2。

8.一種豬圓環病毒2型亞單位疫苗的制備方法，包括如下步驟：

（1）獲得權利要求9所述的重組桿狀病毒；

（2）培養宿主細胞，接種步驟（1）的重組桿狀病毒；

（3）滅活病毒；

（4）分離純化重組PCV2?Cap蛋白；

（5）用純化的重組PCV2?Cap蛋白制備亞單位疫苗。

9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）包括利用生物反應器無血清培養基懸浮培養sf9細胞作為宿主細胞，按感染復數（MOI）為0.001-10的量接種步驟（1）所述的重組桿狀病毒后，繼續培養，使PCV2?Cap蛋白在sf9細胞中高效表達。

10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，生物反應器的培養參數設定為：pH6.0-6.5、溫度25-30℃、溶氧30-80%、攪拌速度50-250rpm，優選生物反應器的培養參數設定為pH6.2，溫度27℃，溶氧50%，攪拌速度100-180rpm。

11.如權利要求8-10任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）包括將細胞經過5L-50L培養體積逐級放大培養后，于50L生物反應器培養并接種所述重組桿狀病毒；或者，將細胞經過5L-50L-500L培養體積逐級放大的培養后，于500L生物反應器培養并接種所述重組桿狀病毒。

12.如權利要求8-11任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）采用批式培養方法、分批補料培養方法、半連續灌注培養方法或連續灌注培養方法的任一種或其組合進行培養，優選為分批補料培養方法進行培養。

13.如權利要求8-12任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）包括向細胞培養液中加入BEI滅活劑滅活所述的重組桿狀病毒，并在滅活結束后使用硫代硫酸鈉中和過量的BEI。

14.如權利要求8-13任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）包括收集步驟（3）滅活后的細胞培養物，通過離心或中空纖維過濾除去細胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的細胞培養上清。

15.如權利要求8-14任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（5）包括對步驟（4）純化的重組PCV2?Cap蛋白進行定量，加入佐劑，制備疫苗。