[發明專利]小腸結腸耶爾森菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應用

有效

• 申請號: 201210268444.4
• 申請日: 2012-08-01
• 公開（公告）號: CN102816715A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 許學斌;袁政安;金匯明
• 申請（專利權）人: 上海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 張勁風

技術領域

本發明涉及腸道病原菌中耶爾森菌屬的小腸結腸耶爾森菌的分離和鑒定方法，特別涉及利用選擇性增菌、選擇性分離培養基對應生長的典型菌落形態、簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗篩選、鑒定包括多種復雜生物型和產毒或非產毒血清型在內的小腸結腸耶爾森的試劑盒、制備和應用。

背景技術

小腸結腸耶爾森菌廣泛分布在自然界中，在野生動物和家養的偶蹄動物中（尤其是豬）體內（包括淋巴系統和循環、腸道等部位）寄生或定殖，屬于目前已知的動物類肉類制品明確檢疫的病原菌，同時，也是能引起食源性傳播和暴發的重要病原菌之一。國內的許多實驗室（包括臨床實驗室和公共衛生實驗室）在實際工作中無法通過可選擇的常規微生物分離方法和材料達到分離的預期效果，反而受制于培養基的批間質控要求繁瑣、敏感性和特異性低以及多次對疑似菌落篩選和鑒定所用自動化生化反應試劑材料的昂貴費用，費工費時。本發明是基于傳統細菌學技術簡化，經提煉、加入創新材料組合成的檢測程序，包括對多種復雜樣品的預處理和選擇性增值，使用選擇性平板分離出所有小腸結腸耶爾森菌的典型菌落，結合簡易生化和特異性酶-底物反應組合試驗同時篩選、鑒定產毒性小腸結腸耶爾森菌的試劑盒和篩選方法，較之現階段使用的傳統分離平板和鑒定技術單純依賴自動化生化鑒定儀器為主的方法更具有綜合成本低、操作簡單、快速、無需依賴特殊儀器且有特異性、準確性及陽性預期值高的優點。適用糞便（或者糞便拭子）、食品、環境水樣等多種增菌標本中小腸結腸耶爾森菌的同步分離和鑒定。

發明內容

本發明的目的是提供一種可利用產毒性小腸結腸耶爾森菌的生物學特性和酶反應試驗鑒定的試劑盒、制備和應用。主要解決現有小腸結腸耶爾森菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復且成本較高、篩選結果不夠直觀的技術難題。本發明針對不同類型標本分別使用2種選擇性增菌液及專一性分離平板配合簡單的糖生化發酵-動力反應模式和細菌特異性酶-底物反應特征建立一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗，達到對產毒性小腸結腸耶爾森菌分離、篩選和簡易鑒定的效果。

本發明的技術方案為：小腸結腸耶爾森菌分離、鑒定的試劑盒及其制備方法，包括：

1、通用型非選擇性增菌液：胰酪胨大豆胨肉湯（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化鈉5.0g，K₂HPO_4?2.5g，葡萄糖2.5g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7.3±0.2（按冷卻至25℃后測量值為標準）。經15磅15分鐘（121℃）滅菌后分裝225ml/瓶備用。

2、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液：胰酪胨大豆胨肉湯（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化鈉5.0g，K₂HPO_4?2.5g，葡萄糖2.5g，蒸餾水100ml，加熱溶解后矯正pH至7.3±0.2（按冷卻至25℃后測量值為標準）。經15磅15分鐘（121℃）滅菌后分裝10ml/瓶備用。

3、耶爾森菌冷增菌液：蛋白胨山梨醇膽鹽肉湯：動物組織胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氫二鈉8.23g，磷酸二氫鈉1.2g，混合膽鹽1.5g，氯化鈉5.0g，加熱溶解后矯正pH至7.6±0.2（按冷卻至25℃后測量值為標準）。經15磅15分鐘（121℃）滅菌后分裝10ml/管備用。

4、耶爾森菌快速選擇性增菌液：替卡西林高氯酸肉湯（TCB）。成分：氯化鎂（含6H₂O）60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%質量百分濃度的孔雀石綠5.0ml，三氯生溶液（用質量百分濃度95%的乙醇配成質量百分濃度0.1%的溶液）1.0ml，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7.6±0.2（按冷卻至25℃后測量值為標準）。經15磅15分鐘（121℃）滅菌冷卻至50℃后加入替卡西林（羥噻吩青霉素，0.1%質量百分濃度水溶液）1.0ml，分裝10ml/管備用。