[發明專利]利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法

無效

• 申請號: 201210268148.4
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102766597A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 田易;倪兵;吳玉章
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及細胞分選方法，具體涉及利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法。

背景技術??

?調節性T細胞(regulatory?T?cell，Treg)是T細胞的一個亞群，能抑制對自身或外源抗原有害的的免疫反應。Treg細胞表達CD4，CD25和轉錄因子FOXP3(forkhead?box?P3，Scurfin)。其中?FOXP3主要表達于胸腺、脾臟和淋巴結等淋巴器官和組織，在小鼠中特異性表達于CD4+CD25+T細胞，而不表達于CD8+T細胞。在人類FOXP3不僅可表達于CD4+CD25+T細胞，還可表達于CD8+CD28-T細胞，但在CD4+T細胞中的表達明顯高于CD8+T細胞。

目前，FOXP3是目前公認的調節性T細胞的最敏感的標志。但是FOXP3定為于細胞內，對Treg細胞進行FOXP3染色，必須要經過細胞固定和通透，對細胞會有一定損壞，所以在現有技術中進行Treg細胞的流式細胞術分選時，通常會選取CD4和CD25這作為標記物進行標記，而不會選取FOXP3為標記物。為了提高分選Treg細胞的靈敏度，急需一種流式細胞術分選Treg細胞的方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法，其靈敏度高，分選的Treg細胞亞群純度高。

為實現上述發明目的，技術方案為：

利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法，具體步驟為：

A.收集外周血單核細胞，用PBS液重懸，然后加入細胞表面標記物CD4抗體和CD25抗體，在溫度為10-28℃條件下孵育；然后用PBS洗滌，離心收集細胞，得洗滌細胞；

B.將步驟A所得洗滌細胞中加入FOXP3固定破膜劑洗滌，然后用FOXP3固定破膜劑重懸細胞，避光孵育，離心收集沉淀；然后用FOXP3固定破膜劑重懸細胞；然后加入熒光標記的FOXP3抗體，室溫避光反應，得FOXP3抗體標記的細胞；

C.將步驟B所得FOXP3抗體標記的細胞加入細胞染色液重懸細胞，上流式細胞儀進行分選。

優選的，所述步驟a是將收集的外周血單核細胞在4℃預冷的PBS液重懸至濃度為1×10⁵~1×10⁷個/100μL，加入CD4抗體和CD25抗體至終濃度分別為0.125-0.25μg/10⁶細胞，在溫度為10-28℃條件下孵育20-40分鐘，然后用PBS洗滌細胞三次，洗滌后在轉速大于1000轉/分鐘條件下，離心至少5分鐘。

優選的，所述步驟a中，加入CD4抗體和CD25抗體至終濃度分別為0.2μg/10⁶細胞，在溫度為18℃條件下孵育30分鐘，洗滌后在轉速為1100轉/分鐘條件下，離心8分鐘。

優選的，所述步驟B中，所述避光孵育時間為30-50分鐘，加入所述熒光標記的FOXP3抗體至抗體終濃度為0.?125-0.25μg/10⁶細胞。

優選的，所述步驟B中，所述避光孵育時間為40分鐘，加入所述熒光標記的FOXP3抗體至抗體終濃度為0.2μg/10⁶細胞。

本發明的有益效果在于：本發明公開的利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法，其方法簡單，不需要特殊試劑；突破了傳統的Treg細胞分選方法，同時用CD4、CD25和FOXP3這三個標記物標記Treg細胞，靈敏度高，分選的Treg細胞純度高，其純度大于99.0%。

附圖說明

圖1為利用FOXP3為標記物分選細胞的結果圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。其中FOXP3固定破膜劑、熒光標記的FOXP3和細胞染色液均購自eBioscience公司。

實施例1?

利用FOXP3為標記物分選Treg細胞的方法，具體步驟為：

A.收集外周血單核細胞約1×10⁶個，用100μL在4℃預冷的PBS液重懸，然后加入細胞表面標記物CD4抗體和CD25抗體，至CD4抗體和CD25抗體的終濃度分別為0.2μg/10⁶細胞，在溫度為18℃條件下孵育30分鐘；然后用PBS洗滌細胞三次，每次洗滌后在轉速為1100轉/分鐘條件下離心8分鐘，棄上清，得洗滌細胞；