[發明專利]煙草漂浮育苗根腐致腐菌的快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210267853.2
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102787159A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 張紹松;李宏光;李永軍;鐘曉田
• 申請（專利權）人: 云南省煙草公司紅河州公司;云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 紅河州專利事務所 53102
• 代理人: 朱躍平

技術領域

本發明屬于一種植物保護技術，特別指一種煙草漂浮育苗根腐致腐菌的快速檢測方法。

背景技術

在煙草漂浮育苗過程中，一段式育苗放盤培養后約50天或兩段式育苗拋苗培養約10天，時常發生根系腐變，影響煙苗移栽成活率和其它病害的協同侵染。導致棄苗率高，造成育苗業主和植煙農戶的經濟損失。然而，煙草漂浮育苗中的根腐現象，現有技術尚未明確致腐的確切原因或致腐生物，未見有關檢測致腐原因或生物的方法。所以目前尚不能對根腐機理進行系統的闡述，也沒有相應的防控技術可供采用，造成煙草育苗過程中極大的損失。因此，研究開發對根腐致腐菌的檢測和防治方法，進而探索根腐發生機理具有十分重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的是提出一種煙草漂浮育苗根腐致腐菌的快速檢測方法，該方法能夠在漂浮育苗中煙苗出現根腐前或出現初期快速檢測出致腐菌，針對育苗池液和根系組織中致腐菌的存在狀況，采取預防和防控措施，減少或者避免根腐苗，提高成苗率，確保煙農育苗和煙草種植的正常生產，?以解決現有技術的不足。

本發明的上述目的通過如下手段實現：

一種煙草漂浮育苗根腐致腐菌的快速檢測方法，其特征在于有如下操作步驟：

（一）建立比對標準

（1）制備LB培養基備用；

（2）分離和培養根腐組織中的菌體；

（3）利用革蘭氏染色法和顯微鏡觀察法確定培養皿中致腐菌生物學特性，建成比對標準；

（二）分離并培養出漂池液中細菌；

（三）革蘭氏染色法觀察、比對培養皿所得漂池液菌落，根據上述對比標準鑒別，得漂池液中根腐致腐菌的定性定量檢測結果。

上述LB培養基可以這樣制備：Trypton?LP0042(OXOID)-10g；Yeast?Extract?LP0021(OXOID)-5g；?NaCl?(AR)-5g；加蒸餾水至1000ml；溶解后調pH至7.2，固體培養基中加入2%的瓊脂粉，分裝至500ml的三角瓶中，121℃滅菌20min，備用。

上述根腐組織中菌體的分離和培養可以這樣進行：(a)用消過毒的剪刀和鑷子取根腐組織，在滅菌水中漂洗3次，置于0.1%的HgCl₂溶液中2分鐘，取出消過毒的根腐組織，在滅菌水中漂洗3次；(b)將消過毒的根腐組織共選5株根系，剪成小段，每植株的根系2段，分別置于已制備好的LB平皿中，25℃培養箱中培養48小時。根系小段長為0.5cm。

漂池液中細菌的分離和培養可以這樣進行：(1)取直徑約9cm的培養皿60套，用報紙以10套/包進行包裝，121℃滅菌20min，備用；

(2)在超凈臺上將熔化的LB培養基倒入滅菌的培養皿中，約15ml/皿，室溫自然冷凝(54套)，按上述試驗處理在每一皿上標號，備用；

(3)取30支試管，每支加入9ml蒸餾水，121℃滅菌20min，自然冷卻至室溫后按上述試驗處理編號，備用；

(4)用裝有滅菌水試管將漂池液樣品依次稀釋成10倍、100倍和1000倍，混勻，分別從稀釋液中取0.2ml，按對應編號加入已制備的LB平皿中，用玻璃涂布棒涂勻；

(5)置上述平皿于25℃培養箱中培養48小時；

(6)取出培養皿，統計每一平皿上的菌落數(總數、不同顏色類群數量)，并換算成單位體積中菌體數量。

所述革蘭氏染色法的過程是：(1)用滴管取無菌水，滴一滴水于載玻片中央，用接種環從平皿中培養物挑取菌落，涂于水滴中，將載玻片底部略靠近酒精燈火焰，烘干載玻片上的涂液；

(2)用革蘭氏染色液對涂抹菌體進行染色；

(3)用滴管中蒸餾水將載玻片上的染色液洗去；

(4)置載玻片于光學顯微鏡的油鏡下觀察染色反應的結果，包括觀察菌體大小和形態，并以圖片和相關描述記錄。

根據上述方法確定的煙草根腐致腐菌一組比對標準的生物學特性是：