[發明專利]葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3、蛋白質及其應用

無效

• 申請號: 201210267302.6
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102776199A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 田易;倪兵;吳玉章
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N5/0783;C07K14/705
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3，還涉及該剪接異構體FR4D3編碼的蛋白質和應用。

背景技術

葉酸受體(folate?receptor，FR)是一種葉酸結合蛋白，這些受體的表達對于細胞從血漿中攝取葉酸非常重要。人的葉酸受體有四種亞型，分別為FR-α,?FR-β,?FR-γ和FR–δ。其中FR-α主要表達在上皮細胞，對葉酸(folate,acid?FA)的親和力較強；FR-β只表達在活化的巨噬細胞表面和起源于造血細胞的惡性腫瘤細胞表面；FR-γ被證實是一種造血組織的分泌蛋白，對葉酸的親和力比FR-α低很多；FR-δ在人的組織中表達量低，很難在組織中被發現，其可能在調節性T細胞表面表達。

在小鼠中，FR-α被稱為葉酸結合蛋白1(Folbp1或FR1)，FR-β被稱為葉酸結合蛋白2(Folbp2/FR2)，葉酸結合蛋白3(Folbp3)，也稱為FR4，與人FR-δ高度同源，具有調節葉酸攝取的功能，同時FR4還與免疫相關，如：FR4可以誘導脾臟和胸腺相關的淋巴組織和淋巴細胞。調節性T細胞(Regulatory?T?cells，Tregs)對于維持自身的免疫耐受和體內免疫自穩非常重要。在對Tregs的分子標記進行研究時發現FR4在天然Tregs上高表達，而且在維持細胞表型中起著非常重要的作用。在以前的研究中，我們鑒別了一種FR4?mRNA剪接異構體，其保留了野生型FR4基因的內含子3，簡稱為FR4v。目前，FR4的其他mRNA剪接異構體未見報道，發現FR4?的mRNA剪接異構體為研究細胞的免疫調節和攝取葉酸奠定基礎，同時為細胞分選提供更多的標記物。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3；本發明的目的之二在于提供mRNA剪接異構體FR4D3編碼的蛋白質；本發明的目的之三在于提供含mRNA剪接異構體FR4D3的重組表達載體；本發明目的目的之四在于提供葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3編碼的蛋白質的應用。

為實現上述發明目的，技術方案為：

1.?葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

2.所述葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

3.含所述葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3的重組表達載體。

優選的，所述重組載體由葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3用XhoI和XbaI酶切后與經同樣酶切的pCI-neo載體連接而成。

4.所述葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3編碼的蛋白質在細胞分選中作為細胞標記物的應用。

本發明中的剪接異構體是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）產生不同的mRNA剪接異構體，而最終的蛋白產物會表現出不同或者是相互拮抗的功能和結構特性，或者在相同的細胞中由于表達水平的不同而導致不同的表型。

本發明的有益效果在于：本發明公開了葉酸結合蛋白3的mRNA剪接異構體FR4D3，為葉酸結合蛋白3新的剪接異構體，與葉酸結合蛋白3成熟的mRNA相比卻失189bp的外顯子3，根據三聯密碼子原理刪除189bp后不會改變FR4的正確翻譯，因此本發明獲得的mRNA剪接異構體FR4D3能正確翻譯為分子量為21kDa的蛋白質。FR4D3蛋白作為一種新蛋白質，能夠作為細胞篩選的新標記物，同時為研究細胞對葉酸的攝取和免疫調節奠定了理論基礎。

附圖說明

圖1為FR4基因及其剪接異構體的PCR擴增結果。

圖2為FR4D3?的核苷酸與氨基酸的對照圖。

圖3為小鼠脾細胞蛋白印跡結果圖。

圖?4為分離純化的脾臟T細胞亞群結果圖。

圖?5為FOXP3陽性的CD4⁺CD25⁺T淋巴細胞亞群結果圖。